维生素B2（核黄素）的荧光测定法

实验原理

维生素B ₂ （核黄素）在440~500nm波长光照射下发生黄绿色荧光。在稀溶液中其荧光强度与维生素B ₂ 的浓度成正比。利用硅镁吸附剂对维生素B ₂ 的吸附作用去除样品中的干扰荧光测定的杂质，然后洗脱维生素B ₂ , 测定其荧光强度。试液再加入连二亚硫酸钠（Na ₂ S ₂ O ₄ ），将维生素B2还原为无荧光的物质，再测定试液中残余荧光杂质的荧光强度，两者之差即为食品中维生素B2所产生的荧光强度。

试剂 和器材

一、 试剂

0.1 mol/L盐酸; 1 mol/L氢氧化钠; 0.1 mol/L氢氧化钠; 20%(w/v)连二亚硫酸钠溶液; 洗脱液：丙酮+冰醋酸+水（5+2+9）; 0.04%溴甲酚绿指示剂; 3%（v/v）高锰酸钾溶液; 3%(v/v)过氧化氢溶液；2.5mol/L无水乙酸钠溶液；硅镁吸附剂：60~100目，sigma 公司产品。

10%木瓜蛋白酶：用2.5mol/L乙酸钠溶液配制。使用时现配制。

10%淀粉酶：用2.5mol/L乙酸钠溶液配制。使用时现配制。

维生素B2标准液的配制：

A) 维生素B2标准储备液（25μg/mL）：将标准品维生素B2粉状结晶置于真空干燥器中。经过24小时后，准确称取50mg，置于2L容量瓶中，加入2.4mL冰乙酸和1.5mL水。将容量瓶置于温水中摇动，待其溶解，冷却至室温，稀释至2L，移至棕色瓶中，加少许甲苯复盖于溶液表面，于冰箱中保存。

B) 维生素B2标准使用液：吸取2.00mL维生素B2标准储备液，置于50ml棕色容量瓶中，用水稀释至刻度。避光，贮于4℃冰箱，可保存一周。此溶液每毫升相当于1.00μg维生素B2。

二、材料

新鲜猪肝或干黄豆。

三、器材

试管 1.5×20cm（×4）; 移液管10mL（×1）, 1 mL（×2）；容量瓶100mL（×1），10mL（×1）；高压消毒锅，电热恒温培养箱，维生素B2吸附，荧光分光光度计。

操作方法

一、样品提取

1．水解：称取2~10g样品（约含10~200μg 维生素B ₂ ）于100ml三角瓶中，加50mL 0.1mol/L盐酸，搅拌直到颗粒物分散均匀。用40ml瓷坩埚为盖扣住瓶口，于121℃高压水解样品30min。水解液冷却后，滴加1mol/L氢氧化钠，用0.04%溴甲酚绿作外指示剂调至pH为4.5。

2．酶解：含有淀粉的水解液：加入3ml 10%淀粉酶溶液，于37~40℃保温约16h。含高蛋白的水解液：加3ml10%木瓜蛋白酶溶液，于37~40℃约16h。

3．过滤：上述酶解液定容至100ml，过滤。此提取液在4℃冰箱中可保存一周。