用温度敏感型启动子表达系统表达目的基因

实验目的
1. 掌握将目的基因插入表达载体中表达目的蛋白的技术路线和试验流程。
2. 了解通过诱导重组DNA表达目的基因的技术。

实验原理

P _L P _R 启动子是大肠杆菌l噬菌体中控制早期转录的启动子，具有极强的起始RNA转录的功能，基因工程中常用它来构建高效表达载体，它受抑制物CI蛋白的负调控。在实际中CI蛋白被改造成温度敏感型(CIts)，由DNA片段CIts857（857bp长）编码。CIts在30℃时具有抑制启动子的活性，在42℃时失活而失去抑制启动子的活性，因此，改变工程菌的培养温度即可控制目的基因的表达，这一点比用诱导剂诱导表达的系统要节省操作步骤和成本，在大规模基因表达中优点尤其明显。有些表达载体本身带有CIts857片段，能自身编码CIts蛋白，对宿主的选择范围较宽；另一些表达载体自身不带CIts857片段，选择宿主茵时，要求宿主是有缺陷的原噬菌体溶源化的菌株（如M5219)，前一类载体表达效率往往更高。
将IL基因以5’端 Eco RI和3’端 Bam HI酶切位点插入pBV220载体多克隆位点中，转化到大肠杆菌JMl03内，便能通过温度的变换控制CI蛋白的活性，继而调节启动子的活性，使IL基因连同其5’端上游带SD序列转录成mRNA并转录终止于rrnB位点，SD序列与ATG的间距为6bp，mRNA作为模板使核糖体高效翻译出IL产物。

实验材料和试剂

（一）实验材料
1．载体：pBV220为中国预防医学科学院病毒学研究所构建。
2．质粒pUCl8-IL。
3．大肠杆菌JMl03。
（二）培养基
l．LB液体培荞基，LB固体培养基（同实验一）。
2．加氨苄青霉素（Amp）的LB固体培荞基（同实验一）。
（三）试剂
1．酶类： Eco RI、 Bam HI、T ₄ DNA连接酶。
2．DNA回收试剂盒。
（四） 仪器
PCR自动扩增仪 微量移液器
离心机 电泳仪
水平电泳槽 透射紫外观察仪

实验步骤

1．用 Eco RI和 Bam HI酶切pBV220（1mg）（酶切方法见实验四），pBV220经纯化后待用。
2．用 Eco RI和 Bam HI酶切pUCl8-IL DNA（4mg），酶切好的600bp IL DNA片段用DNA回收 试剂 盒回收待用。
3．取0.2mg酶切好的pBV220载体加0.2mg 的600bp IL DNA片段，用T4DNA连接酶连接（见实验五）。
4．取连接产物转化JMl03感受态菌，涂布于加Amp的LB固体培养基上。
5．快速抽提质粒；酶切鉴定重组质粒。
6．用接种环取重组克隆于3ml 含50 mg/ml Amp的LB液体培养基的150×15mm试管中，斜置于30℃恒温摇床，200r/min培养过夜。