紫外分光光度法测定蛋白质浓度

[目的]: 掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理，熟悉紫外分光光度计的使用。
[原理] :
蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸。它们具有吸收紫外光的性质，其吸收高峰在280nm波长处，且在此波长内吸收峰的光密度值与其浓度成正比关系，故可作为蛋白质定量测定的依据，但由于各种蛋白质的酪氨酸和色氨酸的含量不同，故要准确定量，必需要有待测蛋白质的纯品作为标准来比较，或且已经知道其消光系数作为参考。另外，不少杂质在280nm波长下也有—定吸收能力，可能发生干扰。其中尤以核酸(嘌呤和嘧啶碱)的影响更为严重。然而核酸的最大吸收峰是在260nm。因此溶液中同时存在核酸时，必须同时测定OD ₂₆₀ nm，与OD ₂₈₀ nm。，然后根据两种波长的吸收度的比值，通过经验公式校正，以消除核酸的影响而推算出蛋白质的真实含量。
本法操作简便迅速，且不消耗样品(可以回收)，多用于纯化之蛋白质的微量测定。主要缺点：当待测的蛋白质与标准蛋白质中的酪氨酸和色氨酸含量差异较大时，则产生—定误差，混有核酸时必须分别测定280nm和260nm两处的OD值，再按公式推算蛋白质含量。
[操作]
取试管7支，按下表操作：

各管混匀，盛于石英杯中，用紫外分光光度计，以空白管调节零点，分别于280nm、260nm波长下测定各管光密度
[计算]
(一) 直接根据标准液与待测液的光密度值(OD280nm)，或从标准曲线，求得样本蛋白质含量。
以标准管各管光密度值为纵坐标，以蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线，然后根据测定管光密度值，直接查标准曲线求得样本中蛋白质的含量。
1． 选一种与待测样本蛋白质氨基酸组成相近似的蛋白质纯品，用生理盐水稀释至浓度为 lmg／m1，作为稀释标准蛋白质溶液。
2．用生理盐水稀释待测样本蛋白质至浓度约为lmg／m1，即为稀释样本蛋白质溶液。
(二)利用经验公式直接计算样本蛋白质含量，
准确吸取血清样本0.1ml，置于50ml容量瓶中，用生理盐水稀释至刻度，即500倍稀释，在280nm和260nm两处波长分别测得光密度值、再按下列公式计算。
1、OD ₂₈₀ ／0D ₂₆₀ ＜1.5时，用Lowry-Kalokar公式：
样本蛋白质含量(mg／m1)＝1.45OD ₂₈₀ 一0.74OD2 ₆₀
2、OD ₂₈₀ ／OD ₂₆₀ ﹥1.5时，用Lamber-Beer定律计算：
样本蛋白质含量(mg／m1) = OD ₂₈₀ ／K×L＝（OD ₂₈₀ ／6.3×1）×10g／L
本实验样品：牛血清白蛋白E ^1% cm＝6.3（100ml／cm.g）
K：克分子消光系数；E ^1% cm：百分比吸光度的吸光系数；
注：不同蛋白质中的酪氨酸和色氨酸含量有差异，故标准管与测定管的蛋白质氨基酸组成应相似，以减小误差。
[器材]
(一)UV-9200紫外分光光度计
(二)50ml容量瓶
[ 试剂 ]
(一) 生理盐水
(二) 清蛋白(人或牛)纯晶
(三) 待测样本蛋白质：用双缩脲法测定蛋白质的样品用生理盐水稀释而成。