生物化学实验基本技术：沉淀和结晶技术

沉淀的基本原理是根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的目的，不同溶解度的产生是由于溶质分子之间及溶质与溶剂分子之间亲和力的差异而引起的，溶解度的大小与溶质和溶剂的化学性质及结构有关，溶剂组分的改变或加入某些沉淀剂以及改变溶液的pH 值、离子强度和极性都会使溶质的溶解度产生明显的改变。
结晶是溶液中的过饱和溶质由液相变成晶体析出的过程。

1. 沉淀

中性盐沉淀
中性盐沉淀是在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程，称为”盐析”。除了蛋白质和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用盐析法进行沉淀分离，20％～40％饱和度的硫酸铵可以使许多病毒沉淀，43％饱和度的硫酸铵可以使DNA 和rRNA 沉淀，而tRNA 保留在上清。盐析法应用最广的还是在蛋白质领域，已有八十多年的历史，其突出的优点是：成本低，不需要特别昂贵的设备；操作简单、安全；对许多生物活性物质具有稳定作用。
(1)中性盐沉淀蛋白质的基本原理
蛋白质和酶均易溶于水，因为该分子的－COOH、－NH ₂ 和－OH 都是亲水基团，这些基团与极性水分子相互作用形成水化层，包围于蛋白质分子周围形成1nm～100nm 颗粒的亲水胶体，削弱了蛋白质分子之间的作用力，蛋白质分子表面极性基团越多，水化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大，因而溶解度也越大。亲水胶体在水中的稳定因素有两个：即电荷和水膜。因为中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性，所以加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即形成沉淀。
(2)中性盐的选择
常用的中性盐中最重要的是(NH ₄ ) ₂ SO ₄ ，因为它与其他常用盐类相比有十分突出的优点：①溶解度大：尤其是在低温时仍有相当高的溶解度，这是其他盐类所不具备的。由于酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定，因而盐析操作也要求在低温下(0～4℃)进行。由表2－6可以看到，(NH ₄ ) ₂ SO ₄ 在0℃时仍有70.6％的溶解度，远远高于其它盐类：
表2－6 几种盐在不同温度下的溶解度(g/100mL 水)

②分离效果好：有的提取液加入适量硫酸铵盐析，一步就可以除去75％的杂蛋白，纯度提高了四倍。
③不易引起变性：有稳定酶与蛋白质结构的作用，有的酶或蛋白质用2～3mol/L 的(NH ₄ ) ₂ SO ₄ 保存可达数年之久。
④价格便宜，废液不污染环境。
(3)盐析的操作方法
最常用的是固体硫酸铵加入法。欲从较大体积的粗提取液中沉淀蛋白质时，往往使用固体硫酸铵，加入之前要先将其研成细粉不能有块，要在搅拌下缓慢均匀少量多次地加入，尤其到接近计划饱和度时，加盐的速度更要慢一些，尽量避免局部硫酸铵浓度过大而造成不应有的蛋白质沉淀。盐析后要在冰浴中放置一段时间，待沉淀完全后再离心与过滤。在低浓度硫酸铵中盐析可采用离心分离，高浓度硫酸铵常用过滤方法，因为高浓度硫酸铵密度太大，要使蛋白质完全沉降下来需要较高的离心速度和较长的离心时间。
各种饱和度下需加固体硫酸铵的量可由附录中查出。硫酸铵浓度的表示方法是以饱和溶液的百分数表示，称为百分饱和度，而不用实际的克数或克分子数，这是由于当固体硫酸铵加到水溶液中去时，会出现相当大的非线性体积变化，计算浓度相当麻烦，为了克服这一困难，有人经过精心测量，确定出1升纯水提高到不同浓度所需加入硫酸铵的量，附录中的实验数据以饱和浓度的百分数表示，使用时十分方便。