酶切常见问题总结
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一、DNA完全没有被内切酶切割
二、DNA切割不完全
三、DNA片段数目多于理伦值
四、酶切后没有观察到DNA片段的存在
五、内切酶保存期内快速失活
六、电泳后DNA片段的带型弥散,不均一
七、酶切后的DNA片段连接效率低
问题 |
原因 |
解决办法 |
DNA完全没有被内切酶切割 |
1) 内切酶失活 |
标准底物检测酶活性 |
2) DNA不纯,含有SDS,酚,EDTA等内切酶抑制因子 |
将DNA过柱纯化,乙醇沉淀DNA |
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3) 条件不适( 试剂 、温度) |
检查反应系统是否最佳 |
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4) DNA酶切位点上的碱基被甲基化 |
换用对DNA甲基化不敏感的同裂酶酶解,重新将质粒DNA转化至dcm-,dam-基因型的细菌菌株 |
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5) DNA酶切位点上没有甲基化(如Dpn I) |
换用不同切割非甲基化位点的同裂酶消化DNA(如San3A I代替Dpn I),重新将质粒转至dcm+ dam+菌株中扩增 |
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6) DNA位点上存在其它修饰 |
将DNA底物与λDAN混匀进行切割验证 |
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7) DNA不存在该酶识别顺序 |
换用其它的酶切割DNA或过量酶消化进行验证 |
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DNA切割不完全 |
1) 内切酶活性下降 |
用5-10倍量过量消化 |
2) 内切酶稀释不正确 |
用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶 |
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3) DNA不纯,反应条件不佳 |
同上 |
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4) 内切酶识别的DNA位点上的碱基被甲基化或存其它修饰 |
同上 |
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5) 部分DNA溶液粘在管壁上 |
反应前离心数秒 |
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6) 内切酶溶液粘度大,取样不准 |
将内切酶稀释,增大取样体积 |
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7) 酶切后DNA粘末端退火 |
电泳前将样品置65℃保温5-10分钟,取出后置冰浴骤冷 |
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8) 由于反应溶液、温度、强烈振荡使内切酶变性 |
使用标准反应缓冲液及温度,避免强烈振荡 |
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9) 过度稀释使酶活性降低 |
适当稀释酶液,反应液稀释的酶不能贮藏 |
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10)反应条件不适 |
使用最佳反应体系 |
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11)识别位点两侧插入了可影响酶切效率的核酸顺序 |
加大酶量5-10倍 |
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DNA片段数目多于理伦值 |
1) 内切酶星状活性 |
检查反应条件:甘油浓度大于12%,盐度过低,Mn2+的存在及酶:DNA值过大均均可导致星状活性,降低酶的用量 |
2) 其它内切酶污染 |
用λDNA作底物检查酶切结果 |
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3) 底物中含其它DNA杂质 |
电泳检查DNA,换用其它酶切,纯化DNA片段 |
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酶切后没有观察到DNA片段的存在 |
1) DNA定量错误(如RNA含量较高) |
用RNA酶A(无DNA酶)100ug/ml消化DNA样,酚抽提后沉淀溶解,定量 |
2) 在酶切反应液中形成非特异的沉淀 |
在反应前透析DNA样品或用酒精沉淀二次 |
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内切酶保存期内快速失活 |
1) 保存温度不合适 |
内切酶贮藏在含50%甘油的贮藏液中,应在-20℃低温保存 |
2) 以稀释形式保存 |
稀释酶液不宜长期存放,应一次使用 |
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3) 贮藏缓冲液不适当 |
使用厂家推荐的贮藏缓冲液 |
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4) 低蛋白浓度 |
内切酶与500ug/ml的BSA一起保存 |
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电泳后DNA片段的带型弥散,不均一 |
1) DNA上结合有蛋白质 |
电泳前上样液65℃加热5min,并加入0.1%的 SDS ,酚/氯仿抽提纯化 |
2) 内切酶中含有DNA外切酶 |
减少酶用量或消化时间,换用新包装的酶 |
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酶切后的DNA片段连接效率低 |
1) 含磷酸盐的浓度高 |
透析,乙醇沉淀去除磷酸盐 |
2) 内切酶失活不全或含有ATP酶 |
延长灭活时间或用酚抽提,乙醇沉淀回收DNA |
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3) 平末端连接 |
加大T4 DNA Ligase用量 |
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4) 外切酶污染 |
减少酶用量,缩短保温时间,酚抽提回收DNA |
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5) 连接 缓冲液 不合适 |
重新配制连接 缓冲液 |