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 葡糖氧化酶法测血糖浓度

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5798

 

 

【实验目的】

 

1. 熟悉定量的基本操作,练习使用定量的计量 仪器 。

 

2. 掌握分光光度计的使用。

 

3. 掌握比色法原理。

 

4. 掌握葡萄糖氧化酶法测定血糖的原理和方法。

 

【实验原理】

 

(一)比色分析法

 

比色分析法是通过比较有色物质溶液颜色的深浅,来测定该物质浓度的方法。有些被检测的物质溶液本身就具有颜色,而有些物质虽不具有颜色,但可于试样中加入某种适宜的试剂,使其产生有色化合物。溶液颜色的深浅与试样中该化学成分的含量成正比。借助于光电比色计和分光光度计,将未知含量的有色溶液和已知含量的有色溶液进行比色,通过计算就可求出未知溶液的含量。

 

其基本原理根据Lambert定律和Beer定律,比色分析法的计算公式亦由此二定律推衍而得。

 

Lambert定律 :一束单色光线通过一有色溶液后,由于溶液吸收了一部分光,所以光线的强度就要减弱。当溶液浓度(C)不变时,光透过的液层越厚,则光线的减弱就越显著。

 

I 0 =光线通过溶液前的强度(入射光强度);

 

I =光线通过溶液后的强度(透过光强度);

 

L =溶液的厚度;

 

I/I 0 =表示光线透过溶液的程度,称为透光度,用 T 表示。则 T = I/I 0

 

Lambert定律证明,- lg I/I 0 L ,即-lg TL

 

写成等式为- lg I/I 0 = K <chmetcnv> <sub>1</sub> L/> </chmetcnv>

 

-lg I/I 0 = lg I 0 /I ,故上式可写成lg I/I 0 = KL

 

令lg I 0 /I为吸光度( A ),或称为消光度( E ),或称光密度( ODD ),所以

 

A= K <chmetcnv> <sub>1</sub> L/> </chmetcnv> ……………………………………………(1)

 

 

 

由(1)式可知,当溶液的浓度不变,溶液的吸光度( A )与溶液液层的厚度成正比,这就是Lambert定律。

 

上式中的 K 1 为常数,其数值与入射光的波长、溶液的浓度及性质有关。

 

Beer定律:一束单色光通过一有色溶液后,若溶液的厚度不变,其透过光的强度与溶液的浓度(C)有关,溶液的浓度越大,则透过光的强度越弱,他们的关系为:

 

- lg I/I 0 ∝C,-lg I/I 0 = -lg T = lg I 0 /I =A

 

故A∝C,写成等式为

 

A= K <chmetcnv> <sub>2</sub> C/>………………………………………………(2) </chmetcnv>

 

K 2 亦是常数,其数值随入射光的波长和溶液的性质而改变。

 

合并上述(1)(2)两式,得

 

A=KCL………………………………………………(3)

 

这就是Lambert-Beer定律,即溶液的吸光度与溶液的浓度和液层厚度的乘积成正比。

 

在比色分析中,在相同条件下对两个性质相同而浓度不同的溶液进行测定,一个为已知浓度的标准溶液,一个为未知浓度的溶液。

 

设:C 1 为标准溶液的浓度;

 

C 2 为未知溶液的浓度;

 

A 1 为测得的标准液的浓度;

 

A 2 为测得的未知液的浓度。

 

按(3)式,则

 

A 1 = K C <chmetcnv> <sub>1</sub> <i>L</i> /> <i></i> ; A <sub>2</sub> = <i>K</i> C <chmetcnv> <sub>2</sub> <i>L</i> /> <i> <sub>2</sub> </i> </chmetcnv> </chmetcnv>

 

移项得 A 1 /C 1 = KL <chmetcnv> <sub>1</sub> A/> </chmetcnv> 2 /C 2 = KL 2

 

在使用光电比色计或分光光度计时,溶液放在固定的比色杯中进行比色,故 L 1 = L 2 ,又因为是同一溶液, K 值相同,上两式的左式相等,故

 

A 1 /C 1 =A 2 /C 2

 

移项得

 

C 2 =A 1 /A 2 ×C 1 …… ……………………………… (4)

 

(4)式是比色分析中常用的重要公式,只要再乘以样品的稀释倍数,就可求得该物质的含量。在以后的实验中要经常用到它,须牢记。

 

(二) 721 型分光光度计的使用方法

 

1. 使用前应检查 仪器 各部件是否正常,各旋钮应位于起始位置。

 

2. 检查电源电压是否与仪器要求相符。

 

3. 接通电源,打开比色槽暗箱,调节0电位钮,使电表指针位于透光度( T )于0处,预热10min。

 

4. 旋动波长选择钮,选择适当波长。用灵敏选择钮选择相应的放大灵敏度(灵敏选择钮先调1档,如调不到0,则再逐步增加高档)。

 

5. 取3只比色杯,分别装入空白液,标准液和测定液,依次放比色槽内。

 

6. 盖上比色槽盖,将空白管置于光路上,调节100电位钮,使指针指到透光度100处。

 

7. 打开比色盖,将指针回到0位,再盖上比色槽盖看指针是否到100处。如调节好后,0电位钮和100电位钮就不可再随意转动。

 

8. 拉动比色杯拉杆,依次将标准液和测定液对准光路,分别读出吸光度数。

 

9. 使用完毕后,将0电位钮和100电位钮恢复到起始位,切断电源。

 

10. 清洗比色杯,倒置于滤纸上晾干,以供下次使用。

 

(三)葡糖氧化酶法测血糖浓度

 

血液中的葡萄糖称为血糖,是糖在体内的运输形式。血糖浓度受神经系统和激素的调节而保持相对稳定,当这些调节失去原有的相对平衡时则出现高血糖和低血糖。糖尿病、颅内压增加、脱水症等均可引起高血糖,饭后、精神紧张可出现生理性高血糖。胰岛β细胞增生或瘤癌等,垂体、肾上腺皮质、甲状腺功能减退,以及严重肝病患者均可出现低血糖症状。饥饿和剧烈运动可引起暂时的低血糖。

 

葡萄糖可由葡糖氧化酶氧化成葡糖酸及过氧化氢,后者在过氧化氢酶的作用下,能与苯酚及4-氨基安替比林作用产生红色醌化合物。醌的生成量与葡萄糖量成正比。

 

 

<rect>/></rect>

【器材和 试剂 】

 

1. 器材 试管及试管架、可见光分光光度计、恒温水浴箱、微量加样器、吸量管、吸耳球、光径 <chmetcnv>1cm/>比色杯、记号笔。</chmetcnv>

 

2. 试剂

 

(1)11mmol/L的酚试剂。

 

(2)二合酶:主要成分为葡萄糖氧化酶(GOD 380U/ml)与过氧化物酶(POD 300U/ml)。

 

(3)葡萄糖标准液(100mg/dL)。

 

(4)磷酸缓冲液:pH7.0 ,100mmol/L。

 

【操作步骤】

 

1. 将1ml二合酶加入磷酸缓冲液,制成酶试剂。

 

2. 将酚试剂与等量酶试剂混合成酶酚混合液。

 

3. 取10ml 试管 3支,标号,按下表加入溶液:

 

试管 号

 

空白管

 

标准管

 

测定管

 

血清(ml)

 

 

 

0.02

 

葡萄糖标准液(1mg/ml)

 

 

0.02

 

 

蒸馏水(ml)

 

0.02

 

 

 

酶酚混合液(ml)

 

3.0

 

3.0

 

3.0

 

4. 将各管分别混匀,置 <chmetcnv> 37℃/> 水浴 中保温10min,然后冷至室温,以空白管校零点,以波长505nm测定标准管和测定管的吸光度值。比色杯光径 <chmetcnv>1cm/>。</chmetcnv> </chmetcnv>

 

5. 计算

 

葡萄糖含量(mmol/L)= (测定管吸光度/标准管吸光度)×100×0.0555

 

(注:本法对葡萄糖有专一性,不受其它糖及还原性物质干扰,其正常值为4.22~6.11 mmol/L。0.0555为换算系数。)

 

【注意事项】

 

1. 酶酚混合液和样品的用量可根据需要按比例改变,计算公式不变。

 

2. 缓冲液中含叠氮钠作稳定剂,不要用嘴吸,避免与皮肤接触。

 

3. 酚试剂有毒,切勿吞咽,如果溢出,请用大量水冲洗被污染的部位。

 

4. 1mL血清吸管,使用完后立即洗净,以免血清凝固在细管内。

 

【思考题】

 

1. 推导比色法定量分析中的公式。

 

2. 简要说明 分光光度计 的操作要领。

 

3. 说明临床测定血糖为何空腹采血。

 

 

 

 

 

 

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