氨基酸的分离鉴定——纸层析法(paper chromatography)
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【实验目的】
1.学习氨基酸纸层析法的基本原理
2.掌握氨基酸纸层析的操作技术
【实验原理】
纸层析法(paper chromatography)是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术,可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定;也是定性或定量测定多肽、核酸碱基、糖、有机酸、维生素、抗菌素等物质的一种分离分析工具。纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法,其中滤纸纤维素上吸附的水是固定相,展层用的有机溶溶剂是流动相。在层析时,将样品点在距滤纸一端约2~3cm的某一处,该点称为原点;然后在密闭容器中层析溶剂沿滤纸的一个方向进行展层,这样混合氨基酸在两相中不断分配,由于分配系数(Kd)不同,结果它们分布在滤纸的不同位置上。物质被分离后在纸层析图谱上的位置可用比移值(rate of flow, Rf)来表示。所谓Rf,是指在纸层析中,从原点至氨基酸停留点(又称为层析点)中心的距离(X)与原点至溶剂前沿的距离(Y)的比值:
在一定条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、温度、湿度、层析滤纸的型号和质量等因素有关。
【器材与 试剂 】
(一)器材
1.层析缸
2.点样毛细管
3.小烧杯
4.培养皿
5.量筒
6.喷雾器
7.吹风机(或烘箱)
8.层析滤纸(新华一号)
9.直尺及铅笔
(二) 试剂
1. 扩展剂(水饱和的正丁醇和乙酸混合液)
将正丁醇和乙酸以体积比4∶1在分液漏斗中进行混合,所得混合液再按体积比5∶3与蒸馏水混合;充分振荡,静置后分层,放出下层水层,漏斗内即为扩展剂。
2. 氨基酸溶液
0.5%赖氨酸、脯氨酸、亮氨酸以及它们的混合液(各组份均为0.5%)。?
3. 显色剂
0.1%水合茚三酮正丁醇溶液。
【实验步骤】
取层析滤纸(长22㎝、宽14㎝)一张,在纸的一端距边缘2~3㎝处用铅笔划一条直线,在此直线上每间隔3㎝作一记号,如右图所示。
1.学习氨基酸纸层析法的基本原理
2.掌握氨基酸纸层析的操作技术
【实验原理】
纸层析法(paper chromatography)是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术,可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定;也是定性或定量测定多肽、核酸碱基、糖、有机酸、维生素、抗菌素等物质的一种分离分析工具。纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法,其中滤纸纤维素上吸附的水是固定相,展层用的有机溶溶剂是流动相。在层析时,将样品点在距滤纸一端约2~3cm的某一处,该点称为原点;然后在密闭容器中层析溶剂沿滤纸的一个方向进行展层,这样混合氨基酸在两相中不断分配,由于分配系数(Kd)不同,结果它们分布在滤纸的不同位置上。物质被分离后在纸层析图谱上的位置可用比移值(rate of flow, Rf)来表示。所谓Rf,是指在纸层析中,从原点至氨基酸停留点(又称为层析点)中心的距离(X)与原点至溶剂前沿的距离(Y)的比值:
在一定条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、温度、湿度、层析滤纸的型号和质量等因素有关。
【器材与 试剂 】
(一)器材
1.层析缸
2.点样毛细管
3.小烧杯
4.培养皿
5.量筒
6.喷雾器
7.吹风机(或烘箱)
8.层析滤纸(新华一号)
9.直尺及铅笔
(二) 试剂
1. 扩展剂(水饱和的正丁醇和乙酸混合液)
将正丁醇和乙酸以体积比4∶1在分液漏斗中进行混合,所得混合液再按体积比5∶3与蒸馏水混合;充分振荡,静置后分层,放出下层水层,漏斗内即为扩展剂。
2. 氨基酸溶液
0.5%赖氨酸、脯氨酸、亮氨酸以及它们的混合液(各组份均为0.5%)。?
3. 显色剂
0.1%水合茚三酮正丁醇溶液。
【实验步骤】
1.准备滤纸