磷酸化蛋白质分析技术在蛋白质组研究中的应用
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王京兰 钱小红
(军事医学科学院放射医学研究所,北京100850)
摘 要 磷酸化修饰蛋白质的分析是蛋白质组研究中的重要内容。对于目前磷酸化蛋白质分析所涉及的各种方法,包括放射性同位素标记,抗体免疫印记等传统方法和以串联质谱各种扫描技术为基础,结合亲和提取、液相色谱2质谱联用等手段的新技术、新方法,以及这些技术在磷酸化蛋白质组学中的应用予以评述。
关键词 磷酸化修饰,蛋白质组,生物质谱,评述
1 引 言
蛋白质的磷酸化修饰是生物体内重要的共价修饰方式之一。在哺乳动物细胞生命周期中,大约有 1 /3的蛋白质发生过磷酸化修饰;在脊椎动物基因组中,有5%的基因编码的蛋白质是参与磷酸化和去磷酸化过程的蛋白激酶和磷酸(酯)酶。磷酸化修饰本身所具有的简单、灵活、可逆的特性以及磷酸基团的供体ATP的易得性,使得磷酸化修饰被真核细胞所选择接受成为一种最普遍的调控手段。蛋白质的磷酸化和去磷酸化这一可逆过程几乎调节着包括细胞的增殖、发育、分化、信号转导、细胞凋亡、神经活动、肌肉收缩及肿瘤发生等过程在内的所有生命活动,目前已经知道有许多人类疾病是由于异常的磷酸化修饰所引起,而有些磷酸化修饰却是某种疾病所导致的后果[ 1 ] 。鉴于磷酸化修饰在生命活动中所具有的重要意义,探索磷酸化修饰过程的奥秘及其对功能的影响已成为众多生物化学家及蛋白组学家所关心的内容。用蛋白质组学的理念和分析方法研究蛋白质磷酸化修饰,可以从整体上观察细胞或组织中磷酸化修饰的状态及其变化,对以某一种或几种激酶及其产物为研究对象的经典分析方法是一个重要的补充,并提供了一个全新的研究视角,由此派生出磷酸化蛋白质组学(phosphop roteomics)这一新概念。规模化的识别和鉴定生物体内磷酸化蛋白质的表达及其变化,在技术方法上还存在很大问题,其中磷酸化修饰蛋白质的识别与检测是影响磷酸化蛋白质组学研究的关键技术之一。细胞内仅有少部分蛋白质被磷酸化,即使蛋白质的表达量处于相对较高的水平,该蛋白质的磷酸化部分的分析也很困难, 一般一个发生磷酸化的蛋白质其磷酸化的部分仅占其总量的10%[ 2 ] 。
2 磷酸化蛋白质检测方法
2. 1 [
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P]放射性标记
[
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P ]放射性标记法是最经典的磷酸化蛋白质检测方法。体内代谢培养用[
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P]标记磷酸盐作为磷酸基团供体,被[
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P ]标记的蛋白质进行一维或二维凝胶电泳分离,用放射自显影或磷储屏检测磷酸化蛋白质。磷蛋白酸水解产物用二维磷酸肽作图法分析可以确定蛋白质的磷酸化氨基酸类型。磷蛋白水解肽段经HPLC分离,通过监测放射性活度收集到磷酸肽,用Edman测序或串联质谱分析都可以确定磷酸化位点,当然这需要有足够量的磷蛋白用于分析。早在1991年, Arrigo等[ 3 ]就采用[
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P]代谢标记和二维凝胶电泳分析的方法观察了细胞在耐热处理后再经热刺激和肿瘤坏死因子刺激后热休克蛋白 hsp28磷酸化程度的变化,发现耐热处理后细胞在热刺激和肿瘤坏死因子刺激下所引起的hsp28的磷酸化程度会显著降低[ 3 ] 。[
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P]放射性标记可以非常灵敏、直观地检测磷蛋白,尤其是与二维凝胶电泳结合后可以从蛋白质组的角度整体观察细胞内蛋白质磷酸化程度的变化,它的缺点是不能标记组织样本,并且存在放射性污染的问题。
2. 2 免疫印记和免疫沉淀
通过抗磷酸氨基酸抗体与磷酸化蛋白质的免疫印迹反应(Western blotting)来检出磷酸化蛋白质是较常用的方法。在真核细胞中最常见的磷酸化修饰是在蛋白质的丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基侧链羟基磷酸化。已经有商品化的抗酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸磷酸盐抗体,其中抗酪氨酸磷酸盐抗体的特异性最好,也最为常用。磷酸化丝氨酸和苏氨酸的抗原决定簇较小,抗原抗体结合位点有空间障碍,所以抗体的结合力较差[ 4 ] 。与功能相关的磷酸化蛋白质组研究工作较多使用抗体免疫印迹法,研究在各种生长因子等因素的刺激下,细胞内蛋白质磷酸化状态的变化,进而探讨有关的信号转导途径或生理机理。 Csar等[ 5 ]用二维电泳和免疫印迹技术比较了鼠造血细胞FDC2P1的野生型和CSF受体突变型(Y807F) 在CSF刺激前后细胞酪氨酸磷酸化蛋白质的变化,发现Y807F突变使部分蛋白质磷酸化程度增强,部分减弱,还有部分与Y807F突变无关。进一步的研究证实在磷酸化程度显著减弱的蛋白质中有蛋白质 p46 /52Shc ,并发现其可能在CSF - 1诱导的巨噬细胞分化过程中发挥重要作用。Kim等[ 6 ]研究了辐射诱导纤维肉瘤细胞系及其耐热衍生物在热休克刺激下的酪氨酸磷酸化蛋白质表达谱的变化,发现有93个蛋白质的磷酸化程度随热休克恢复时间发生显著变化,鉴定出的81个蛋白质具有广泛的细胞功能,作者认为这提示热休克应答可以通过多种蛋白质的磷酸化而被调节。
免疫印迹法与免疫沉淀相结合,可以在电泳之前先富集目的蛋白质,但这样也有可能丢失部分低丰度的目的蛋白质,同时免疫沉淀技术对抗体的要求更高,抗磷酸酪氨酸抗体具有较好的亲和性可以进行免疫沉淀实验[ 7 ] ,抗磷酸丝氨酸和苏氨酸抗体由于亲和力低,多年来一直没有用于免疫沉淀分析。 Gronborg等[ 8 ]对多种商品化的抗磷酸丝氨酸/苏氨酸抗体的免疫沉淀性能进行了评价,发现有3种抗体可应用于免疫沉淀,并成功富集了磷酸酶抑制剂calyculin A诱导的HeLa细胞磷酸化蛋白质。 …………………………
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