Western转印的优化

从SDS凝胶中进行Western蛋白转印的优化需要对一系列参数进行考虑。目的是转印所有凝胶上的蛋白并将其定量地转移到转印膜上。进行高效转印需要一定程度的优化，尤其是对于大分子量和小分子量蛋白。

转印后，凝胶上应不残留或残留很少的蛋白。可以在转印后进行染色进行检测。转移出凝胶的蛋白应该仅在接触凝胶的膜的一面可见。如果有怀疑，在转印时使用第二个"支持膜"，你可以在转膜后染色，以检查是否有穿膜的迹象。如果发现蛋白残留在凝胶上而且膜的结合性很差，可以考虑下列因素：

SDS vs 酒精

在多数转印实验步骤中都使用SDS和酒精。但两者对于成功的转印有相反的作用，需要根据欲转印蛋白的性质加以优化。

SDS对于蛋白的迁移是必要的，尤其有助于大分子量蛋白从凝胶上的转移。但由于膜结合需要疏水相互作用，SDS过多会抑制结合，尤其对于硝酸纤维素膜。如果从蛋白上剥离太多SDS，将无法将蛋白转移出膜。作为一个一般性的规则，如果膜的结合力有效，但蛋白仍旧残留在凝胶上，在转印缓冲液中加入0.01％会促进完全转印。建议的步骤在转印缓冲液中不含有SDS，但凝胶在电泳后不需要浸泡在转印缓冲液中；凝胶中残留的SDS对于有效的转印已经足够。但另一方面，酒精通过在蛋白上剥离SDS促进蛋白和膜的疏水接合。一般在转印缓冲液中加入20％的甲醇会增加硝酸纤维素膜的接合能力。

凝胶浓度

丙烯酰胺浓度越低，蛋白越容易转移下来。选择可以分离蛋白的浓度最低的凝胶。梯度胶适用于转印一系列不同大小的蛋白，因为凝胶的孔与不同大小的蛋白匹配良好。

凝胶厚度

蛋白比较易于从薄胶上转移下来，所以上样体积允许，使用1.0mm厚的胶取代1.5mm的胶。

电场（电压×时间）

如果电压过低而且转印时间过短，部分蛋白会残留在凝胶上。如果电压过高，小蛋白会在结合到膜上前透膜而出。如果按建议的条件转印后有蛋白残留在胶上，增加电压可能会有帮助，但不要超过5V。但注意，一旦SDS从蛋白剥离，增加转印时间或提高电压就无效果。一旦结合，即使延长转印时间，大部分蛋白也会保持在膜上。

膜的类型

结合到硝酸纤维素膜上主要通过疏水键。硝酸纤维素膜对于常规使用非常好。对于小的多肽，建议使用小口径的膜。

PVDF比硝酸纤维素膜更疏水，在转印过程中结合蛋白更紧密，可以耐受更多的SDS。目前，PVDF一般比硝酸纤维素膜需要更严谨的封闭条件。其适用于蛋白测序。

尼龙膜通过疏水和静电相互作用结合。其SDS耐受度甚至高于PVDF，但也需要更严谨的封闭条件。主要建议用于Northern和Southern。