Western Blotting 膜法学堂：选择正确的转印膜，优化
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PVDF膜与硝酸纤维素膜的比较：
PVDF膜的材质是由 Millipore 公司在1985年首创并应用于蛋白转印。由于PVDF膜与硝酸纤维素膜相比有许多突出的优点，包括更好的蛋白质保留率、更高的机械强度和更广的化学相容性(Pluskal, et al., 1986)，因此被广泛使用于免疫检测实验当中。其中更高的机械强度和更优的化学相容性使PVDF膜成为免疫检测中染色和二次免疫检测时的理想选择。PVDF膜不易撕裂，有更长的保质期，不会像纯硝酸纤维素膜那样放久了会裂或卷曲，而且更容易做抗体洗脱和二次抗体结合。使用PVDF膜的另一个优势是，PVDF膜能兼容更多的下游实验：如使用考马斯蓝染色配合的条带切割和氨基端测序、蛋白质水解/肽段分离/内部测序以及免疫检测等应用 (Kurien, et al., 2003)。 硝酸纤维素膜典型的蛋白结合量是80-100 μg/cm2，而PVDF膜的结合量是100–300 μg/cm2，更高的蛋白结合量能帮助免疫检测获得更清晰的条带和提高检测的灵敏度。一个对PVDF膜和硝酸纤维素膜作直接比较的HIV蛋白血清学实验的结果显示，PVDF膜对总HIV抗原有更好的截留并改善了抗体对糖基化的包装抗原的检测效果(Lauritzen and Pluskal, 1988)。 不同型号的PVDF膜的选择： PVDF膜也有不同的型号，选择对了合适的型号有助于获得更好的免疫检测结果。 大家最熟悉的Immobilon-P 型号作为全球第一个的PVDF膜，是被使用最广泛和文献引用最多的型号，至今已有超过五万二千篇国际期刊的文献使用了Immobilon-P。对于一般的化学发光的免疫检测，使用Immobilon-P 型号就可以了。 但有些特殊情况需要选择特别的转印膜。转印膜的显微结构其实是疏松多孔的材质，膜的孔径大小和膜的厚度等参数会影响不同分子量蛋白质的结合量和截留率。Immobilon-PSQ 型号的PVDF膜由于具有更均一的孔径以及更厚的横截面，因此其内表面积是其它大部分膜的3倍，再加上Immobilon-PSQ 型号的膜孔径是更小的0.2 μm，所以Immobilon-PSQ 具有更高的蛋白质载量，并提高了小分子蛋白质的截留率。前面也提到过，更高的蛋白质载量能获得更强的信号。另外，提高小分子蛋白质的截留率可以防止低分子量蛋白质在电转过程发生流穿现象造成的损失。总的来说，假如你需要免疫检测低分子量蛋白质（小于20kDa，比如组蛋白），或者你做肽段测序需要100%的蛋白质保留率，或者目标蛋白的表达丰度低，又或者由于检测抗体的亲和力弱使你的Western Blotting结果不好，这些情况下更适合的选择是Immobilon-PSQ 型号的PVDF膜。 有另外一种情况也是需要选择特殊型号的转印膜，那就是荧光检测的Western Blotting实验。普通型号的Immobilon-P 的PVDF膜由于有高荧光背景而不适合荧光检测。硝酸纤维素膜荧光背景较弱，有些老师也会用于Western Blotting的荧光检测，但也有老师抱怨检测信号不如使用PVDF膜的化学发光强，较弱的条带不易检测。针对这种情况，低荧光背景的Immobilon-FL 型号PVDF膜被研发出来了。Immobilon-FL 型号由于具有比硝酸纤维素膜更低的自发荧光背景，同时又保留了PVDF膜更好的蛋白质保留率等特点，因此能提高荧光检测的信号强度，即使是很弱的条带也能检测到。同时，由于Immobilon-FL 膜是第一个专门针对荧光Western Blotting检测的转印膜，而且是唯一能适用于近红外波长的转印膜（700-800nm），Immobilon-FL 膜也有越来越高的文献使用率（超过九千篇国际期刊的文献）。 现在大家对于不同的膜的特点更清楚了吧！下面的表格里列举了不同材质的膜的一些参数（包括不同分子量的蛋白质的截留量，Immobilon-FL 的蛋白质截留量等参数与Immobilon-P 类似，就没有列举在这里了），另外还有不同膜的荧光免疫检测的对比试验，帮助大家更好地理解不同的膜的特点。相信大家以后能选择更合适的转印膜以达到最佳的实验结果！ (责任编辑：大汉昆仑王) |
