RNAi技术路线选择及应用
互联网
RNAi研究的一般技术路线是:
由上述的路线可以看出,获得高纯度的siRNA产物是进行实验的第一步,而转染的效率则是非常关键的因素。
一、siRNA的设计
在制备siRNA 前都需要单独设计siRNA序列。研究发现对哺乳动物细胞,最有效的siRNAs是21-23个碱基大小、3‘端有两个突出碱基的双链RNA;而对非哺乳动物,比较有效的是长片段dsRNA。siRNA的序列专一性要求非常严谨,与靶mRNA之间一个碱基错配都会显著削弱基因沉默的效果。
选择siRNA靶位点:
从转录本AUG起始密码子开始,搜寻下游AA序列,记录跟每个AA 3’端相邻的19个核苷酸作为候选的siRNA靶位点。有研究结果显示GC含量在30%—50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效。Tuschl等建议在设计siRNA时不要针对5"和3"端的非编码区(untranslated regions,UTRs),原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域,而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA的效果。
序列同源性分析:
将潜在的序列和相应的基因组数据库(人,或者小鼠,大鼠等等)进行比较,排除那些和其他编码序列/EST同源的序列。例如使用BLAST( www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)选出合适的目标序列进行合成。并非所有符合条件的siRNA都一样有效,其原因还不清楚,可能是位置效应的结果,因此对于一个目的基因,一般要选择3-5个靶位点来设计siRNA。
通常来说,每个目标序列设计3—4对siRNAs,选择最有效的进行后续研究。
设计阴性对照:
一个完整的siRNA实验应该有阴性对照,作为阴性对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成,但是和mRNA没有明显的同源性。通常的做法是将选中的siRNA中的碱基序列打乱。当然,同样要保证它和其他基因没有同源性。
此外网上提供免费的siRNA设计工具www.qiagen.com/siRNA, http://bioinfo.clontech.com/rnaidesigner/