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定量PCR技术简介

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一、 定量PCR的基本原理:
在PCR实验条件下(Mg++、缓冲液、Taq酶、dNTP、引物、模板),经变性→退火→延伸的一个循环,引物在退火阶段与相应的模板结合,在延伸阶段进行复制,此时产物为:Yn=Yn-1×(1+Ev) ,Yn:n个PCR循环后PCR产物的分子数;Yn-1:为n-1个热循环后PCR产物的分子数;Ev:为扩增效率,0≤Ev≤1;若n个热循环中其Ev是一致的话,经n个循环后的扩增产物的分子数(Y)和反应物中原始分子数(X)之间关系,可描述为:Y=x×(1+ Ev)n。
1. 终点法定量原理:
在最佳实验、循环次数n一定、Ev相同的前提下,根据扩增产物的量可以计数出反应物中原始分子数,若核酸提取效率相同(与标准品),进而计算出标本中靶分子的准确含量,即:
lnx=lnY-n×ln(1+Ev)=lnY - b (b为常数)
2. 实时检测法定量原理:
在最佳实验、相同Ev以及相同扩增产物的情况下,反应物中原始分子数(X)与其所需要的扩增循环次数(n)成反比,若核酸提取效率相同(与标准品),进而计算出标本中靶分子的准确含量,即:
LgX=LgY–n×Lg(1+Ev)=b - n×a (a、b为常数)3. 扩增效率(Ev)的影响因素:
以上所述的定量原理均假定反应体系中扩增效率是不变,但是,实际上,Ev在不同的扩增管之间和同一扩增管的不同循环次数之间是不同,如何控制及解决Ev的变异以及标本制备的可靠性是PCR定量的可靠性所在,也是定量PCR的发展方向,那么,Ev的影响因素有:
a. 引物和靶序列的结合能力(G+C%及突变),扩增产物的长度,G+C含量。
b. 模板的含量、DNA聚合酶、反应液成分变化。
c. 不同临床标本间DNA聚合酶抑制物的存在情况。
d. 循环扩增仪上不同位置的差异。

二、 定量PCR方法的分类:
目前对标本的靶DNA或基因的相对或绝对含量是不同样品的PCR产量检测而推算出来,根据标本中是否加入内标物,将分成以下两种:

(一) 外标法定量PCR:
一个已知含量的标准品(通常用质粒)经一系列的稀释后与待检标本一起进行扩增,制作PCR扩增产物和靶核酸含量的标准曲线,根据待检标本的扩增产物量即可推算出靶核酸的绝对含量;上述已提及不同标本间的扩增效率(Ev)的差异,对样本间PCR产量作比较会产生很不准确的结果;以外还应考虑“平台效应”对结果的影响,因为“平台期”PCR产物量并不受初时模板量的影响;导致结果的准确性和重复性差,因此采用外标法应该注意:
a、 注意标准化操作,优化最佳实验条件,减少标本间Ev的差异导致对结果的影响。
b、 标准品的稀释因存在随机分布而导致结果的不准确。
c、 注意“平台效应”对实验结果的影响。特别是后面提及的终点法检测PCR产物的方法中。
d、 由PCR方法很灵敏,特别RT-PCR方法,没有内标存在的情况下,标本的污染而对实验结果产生很大的影响。
e、 标本处理对结果的影响。

(二) 内标法定量PCR:
由于上述提及的外标法存在不同标本间的Ev差异和标本的提取(特别是RT-PCR)的微小变化都将导致扩增产物的巨大差异。为了清除此种影响,国内外都推重采用内标法。内标法是用PCR技术进行准确定量的基础和今后的发展方向,根据采用内标品的不同,又分为非竞争内标定量PCR(quantitative PCR with noncompetitive intenal standands)和竞争定量PCR(competitive quantitative PCR)

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