我的RT-PCR实验(人VI 型胶原蛋白α1 链的克隆)

流程和实验结果如下，给做RT-PCR 的战友一点参考。

首先引物设计
引物设计有3 条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。
具体实现这3 条基本原则需要考虑到诸多因素，如引物长度（primer length），产物长度 （product length），序列Tm 值 (melting temperature)，引物与模板形成双链的内部稳定性(internal stability, 用ΔG 值反映)，形成引物二聚体(primer dimer)及发夹结构（duplex formation and hairpin）的能值，在错配位点（ false priming site ） 的引发效率， 引物及产物的GC 含量（composition），等等。必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。根据有关参考资料[24]，引物设计应注意如下要点：
（1）引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于 Taq DNA 聚合酶进行反应。
（2）引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增加。
（3）引物3’端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。5’端序列对PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。
（4）引物序列的GC 含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC 含量不能相差太大。
（5）引物所对应模板位置序列的Tm 值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm 值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo 软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method) 。
（6）ΔG 值是指DNA 双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端ΔG 值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间ΔG 值相对较高的引物。引物的3’端的ΔG 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。
（7）引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行[8]。
（8）对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载体的相应序列。

1.1.1 PCR 的引物设计
首先从GenBank 查到VI 型 胶原蛋白 的α1 链的mRMA 序列，序列号为 NM_001848 .其序列长为 4164bp，其中98 到3184 为VI 型胶原蛋白的α1链的编码序列，98 到865 编码VI 型胶原蛋白的α1 链的氨基端球状结构域，
866 到1873 编码胶原的三股螺旋结构域，1874 到3181 编码VI 型胶原蛋白的α1 链的羧基端球状结构域。
接着采用Primer Premier 5.0 进行引物设计，设计结果如下：

 

图2-1 Primer Premier 5.0 进行引物设计
由表中可知引物的GC 含量较高，扩增的片断较长，而且存在错配和引
物二聚体，在进行PCR 扩增时存在一定的困难。