利用随机扩增多态性DNA 指纹技术对猪链球菌进行基因分型

倪宏波1 ,3 , 欧阳素贞2 , 王兴龙3 , 鲁会军3 , 雷连成3
(1. 黑龙江八一农垦大学动物科技学院, 黑龙江密山　158308 ; 2. 安阳大学畜牧兽医系, 河南安阳　455000 ;
3. 解放军军需大学动物科学系, 吉林长春　130062)
摘要: 通过优化反应条件和筛选随机引物,应用100 条随机引物对分离的20 株猪链球菌做随机扩增多态性DNA(RAPD) 分型研究。结果表明,有27 条引物呈现良好的多态性和稳定性,可产生稳定、复杂的指纹图谱。采用SPSS10. 0 软件分析了不同菌株之间的遗传距离,绘制出了菌株间的亲缘关系树状图,结果,20 株猪链球菌被分为4 个聚类群。
关键词: 猪链球菌; 随机扩增多态性DNA; 指纹图谱; 基因分型

　猪链球菌病是由链球菌感染引起的猪的一类疾病的总称。随着我国工厂化养猪业的不断发展,猪链球菌病已成为危害养猪业的一种重要疾病。该病一年四季均可发生,侵害不同年龄的猪,由于链球菌血清型多、抗原结构复杂,在临床上可呈现不同的特征,如败血症、脑膜脑炎、心内膜炎、肺炎、化脓性淋巴结炎、关节炎、支气管肺炎等,还常与其他疾病合并感染,发病率和死亡率较高[1～6 ] 。因此,快速而准确地对该菌进行分型,不仅为该病的诊断、治疗提供依据,而且对该病的流行病学调查具有重要的意义。
长期以来,链球菌的分型通常是以生物学和抗原特性为基础,主要依靠其形态、培养和生化特性、血清学方法、荚膜型、细菌素及噬菌体生物型等方法。近年来,国内外开始应用分子生物学技术,如质粒指纹图谱(plasmid fingerprinting) 、脉冲场电泳(pulse field gel electrophoresis ,PFGE) 、限制性酶切分析( restriction ndonuclease fingerprinting ,REF) 、扩增片段长度多态性分析(am-lified fragment length polymororphism ,AFLP) 等进行链球菌的分型研究, 但这些技术存在技术复杂、耗时、分辨率低或重复性差等缺点。随机扩增多态性DNA 指纹(randomly am-lified polymorphic DNA ,RAPD) 技术对以上缺点有所改善,并具有样品用量少、灵敏度高、检测容易等优点。本研究旨在利用RAPD 技术对临床分离的20 株猪链球菌进行分型研究。

1 　材料与方法
1. 1 　菌株
供试菌株来源于发病猪场、小动物门诊及黑龙江八一农垦大学动物科技学院微生物教研室。所分离菌株均经形态学、生化试验和血清学试验鉴定证实,菌株编号为1～20。
1. 2 　试剂
琼脂糖、PCR Buffer (含Mg2 + ) 、4 ×dNTP、DL2 000 Marker、SDS、CTAB、蛋白酶K、RNA 酶、100 条10 聚寡核苷酸随机引物、Tris 饱和酚和EDTA 等:均购自北京鼎国生物技术发展公司;Taq NA 聚合酶:为科隆公司的promege 分装产品;其他常规试剂:均为国产分析纯。
1. 3 　随机引物
100 条10 聚寡核苷酸随机引物,购于北京鼎国生物技术发展公司。
1. 4 　方法
1. 4. 1 　猪链球菌全基因组DNA的提取　根据文献[7 ] 稍加改进。
1. 4. 2 　RAPD 反应条件优化及引物筛选　利用100 条随机引物对20 株猪链球菌基因组DNA 进行随机扩增,将结果稳定且有多态性的引物用作RAPD 分析。根据文献报道,大致确定各组分的浓度后对各组分和反应条件逐个进行优化,确定其最佳浓度和扩增反应条件。主要优化了对RAPD 影响较大的2 个反应参数,即PCR 反应体系中的Mg2 + 浓度(1. 5、2. 0、2. 5、3. 0、3. 5、4.0、4. 5 mmol/ L) 和DNA 模板浓度(10、50、80、100、120、150、200 ng/μL) 。反应体系为25μL ,内含1. 5 U Taq 酶、10 mmol Tris2HCl 缓冲液(pH 8. 0) 、50 mmol KCl、0. 1 mmol dNTP 及8 pmol 随机引物。PCR 反应液覆盖25μL 矿物油后进行扩增。94 ℃预变性5 min ,然后94 ℃反应1 min ,35 ℃反应1 min ,72 ℃反应2 min。40 个循环后72 ℃保温20 min ,以使延伸反应充分完成。取15μL 扩增产物用15 g/ L 琼脂糖凝胶电泳检测,观察结果。
1. 4. 3 　RAPD 指纹图谱分析　以所有分析菌株为变量,不同的扩增产物为样本,统计扩增结果。以遗传距离为聚类统计量,采用最小距离法,经SPSS 10. 0 软件统计出各菌株的欧氏遗传距离,并进行聚类分析,绘出亲缘关系树状图。

2 　结果
2. 1 　RAPD 随机引物筛选及反应条件的优化
在100 条随机引物中有68 条引物有扩增产物,其中10 条引物为单态性,27 条引物多态性较好。在RAPD 条件优化中,发现Mg2 + 在2. 5 mmol/ L 时有较高的扩增效率,且非特异性低; 当Mg2 + 浓度降低时,扩增效率随之降低;Mg2 + 浓度过高,非特异性扩增增强。DNA 模板浓度在50 ng/μL 时有较好的扩增结果,当浓度较高时,扩增条带模糊不清,甚至出现涂抹带。　　　
2. 2 　RAPD 结果
100 条引物中,有32 条引物无法扩出稳定的带型或无扩增产物。其中27 条引物可分别产生3～12 条片段,表现出较高的多态性,能应用其分析的猪链球菌种内的遗传差异,从而对其分型。扩增结果如图1 和图2。

图1 　引物OPO20 扩增结果
1～20 为试验时的菌株编号,M为Marker

图2 　引物OPM04 扩增结果
1～20 为试验时的菌株编号,M为Marker