PCR操作范例及反应体系的组成

　　一、PCR操作范例

　　在一个典型的PCR反应体系中需加入：适宜的缓冲液、微量的模板DNA、4×dNTPs、耐热性多聚酶、Mg ²⁺ 和两个合成的DNA引物。模板DNa 94℃变性1min，引物与模板40～60℃退火1min，72℃延伸2min。在首次循环前模板预变性3～5min；在末次循环后，样品仍需继续延伸3～5min以上，确保扩增的DNA为双链DNA。为便于了解PCR反应中各成份的组成，加入量和反应条件，使人们以此为基础，对不同的研究对象逐项改变来找到最佳反应条件，特列举Perkin Elmer Cetus公司Gene Amp DNA 试剂 盒提供的典型反应条件供参考。

表22-1 PCR反应混合液

成分	加入体积（μl）	最终浓度
双 蒸馏 水	53.5
10×反应缓冲液 [1]	10.0	[1×]Mg 2+ 1.5mmol/l K + 50mmol/L
4×dNTPs(各1.25mmol/L)	16.0	各200μmol/L
λ-DNA模板（全长48.5kD）	10.0	1ng/次
引物1,2（各25bp,20μmol/L） [3,4]	5.0	1.0μmol/L（100pmol）
Taq聚合酶储存液 [2]	0.5	2U/100μl
总体积（pH8.3）	100.0
石蜡油	50～100.0

扩增条件：94℃60s,37℃60s,72℃120s,共25～30个循环。

注：[1]反应缓冲液[10×]含：100mmol/l Tris-HCl pH8.3(25℃),

　　15mmol/L KCl, 15mmol/L MgCl ₂ ,

0.01%(W/V)明胶（Sigma G2500）

[2]酶储存缓冲液（-20℃）含：50%甘油，100mmol/l KCl,

20mmol/L Tris-HCl ph8.0

0.1mmol/L EDTA, 1.0mmol/L DTT

200μg/ml明胶

0.5%吐温20，0.5% Nonidet P40

[3][4]引物，1，2：扩增λ-噬菌体基因中500bp的片段

引物1序列：7131～7155（5’）-GATGAGTTCGTGTCCGTACAACTGG-(3’)

引物2序列：7606～7630（5’）-GGTTATCGAAATCAGCCACAGCGCC-(3’)

注意（3’）端有2个bp互补故易生成50bp的双体

二、PCR反应系统的组成

（一）PCR缓冲液（PCr Buffer）

　　用于PCR的标准缓冲液见PCR操作范例。于72℃时，反应体系的pH值将下降1个单位，接近于7.2。二价阳离子的存在至关重要，影响PCR的特异性和产量。实验表明，Mg ²⁺ 优于Mn ²⁺ ，而Ca ²⁺ 无任何作用。

　　1．Mg ²⁺ 浓度Mg ²⁺ 的最佳浓度为1.5mmol/L(当各种dNTP浓度为200mmol/L时)，但并非对任何一种模板与引物的结合都是最佳的。首次使用靶序列和引物结合时，都要把Mg ²⁺ 浓度调到最佳，其浓度变化范围为1～10mmol/L。Mg ²⁺ 过量易生成非特异性扩增产物，Mg ²⁺ 不足易使产量降低。