PCR技术：PCR产物测序

PCR技术代替了为测序而反复进行的分子克隆和模板制备步骤。PCR技术与自动测 序技术相结合后，它将成为一种最快、最有效的测定核苷权序列的方法。本章主要综 述各种测模板的制备以及如何完成PCR产物的直接测序。与传统的将PCR片段克隆入质 粒或病毒基因组相比，直接序列分析有两个主要的优点:1)由于它是一个不依赖于生 物体(如细菌、病毒等)的体外系统，因而它更容易标准化(即例于自化2);对于每个待 测样品，只需测定一个单链序列，因而它也就更快和更准确。相比之下，间接测序为 了区别在PCR反应过程中由DNA聚合酶引入的随机错朽核苷酸所引起的原始基因组序列 中的突变，以及由体外重组而产生的人工扩增产物，如产生镶嵌等位基因(混合克隆) 等，每个样品不得不测定几个PCR产物克隆的序列。

不需借助在细菌中克隆就可直接获得清蜥和准确的序列结果，其难易程度取决 于:1)只扩增靶序列的PCR引物的扩增能力(通常称为PCR特异性);2用以获笪测序模板 的方法。与引物物异性及模板制备有关的问题将在下面谈到。虽然DNA测序的化学法 (Maxam-Gilbrt)可以用来直接测序，但我们这里仅讨论Sanger的末端终止法。

最佳的PCR条件

　　PCR反应的特异性在很大程度上是由寡聚核苷酸引物的序列所决定的。对于特定 的引物组，PCR的特异性可以由于采用最佳的反应条件、退火温度和PCR缓冲液中的 MgCl2浓度而发生明显的变化。如果用标准的1.5mM的MgCl2浓度不能得到所需的特异 性PCR产物，我们建议MgCl2的终浓度为1.4∽2.5mM之间，以0.2mM增长率来改变MgCl2 浓度，以选择最佳Mg++浓度。一个较常遇见的问题是，使PCR特异性达到最高的MgCl2 浓度导致PCR扩增失败(dropouts)。这可能是由于模板DNA溶液中有较高的EDTA，它隆 低了提供给Taq DNA聚合酶MgCl2量。因此，对于扩增溶解在TE(1mM EDTA)中的DNA， 我们建议用含2.0mM的MgCl ₂ 的PCR缓冲液。

PCR反应的温度范围包含有三个不同的恒定期:变性期、退火期和延伸期，还有它 们之间的过渡期。为了获得用于序列分析的模板或杂交探针的单链DNA，通常并不需 要改变参数。

凝胶纯化PCR扩增的靶序列

如果最佳PCR反应条件不能产生所需的特异性产物，可采用新的寡核苷酸重新进 行扩增，或用凝胶电泳来分离不同的PCR产物，而后再各自重新扩增进行序列分析。 长度不同的片段可以用琼脂糖凝胶电泳来分离:

1.片段大小在80-100bp时，可采用3%NuSieve1%普通琼脂糖或用聚丙烯酰胺胶来 分离。

2.从胶上切下含所南非PCR片段的薄片。

3.加入50∽100μlTE浸泡胶片，可反复冻融或放置几个小时使DNA从胶中扩散出 来。

4.取少量(1-5%)进行第二次扩增，为得到纯净单一的产物，用于第二次PCR扩增 的凝胶抽提物的量必须少于1ng。

5.现已发现琼脂糖含有抑制Tab聚合酶活的物质。因而，如需重新扩增供Tab聚合 酶测序用的片段，最好用丙烯酰胺电泳分离。

当用PCR引物扩增几个同样长度的相关序列时，如来自几个新近复制的基因，或 重复序列或保守的信号序列(conserved signal sequences)的同样显子，可以通过下 列两种不同方法来改进电泳分离。1).先用只切割某一模板的内切酶进行酶切，而后 电泳纯化完整的PCR产物。2).用可使核苷酸序列不同的扩增产物分开的电泳系统。下 一个部份将讨论此类系统中的变性甲酰胺梯度凝胶系统。采用方法一时，必须事先了 解在不同PCR产物中的内切酶位点。