PCR技术：PCR产物测序
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PCR技术代替了为测序而反复进行的分子克隆和模板制备步骤。PCR技术与自动测 序技术相结合后，它将成为一种最快、最有效的测定核苷权序列的方法。本章主要综 述各种测模板的制备以及如何完成PCR产物的直接测序。
与传统的将PCR片段克隆入质 粒或病毒基因组相比，直接序列分析有两个主要的优点:1)由于它是一个不依赖于生 物体(如细菌、病毒等)的体外系统，因而它更容易标准化(即例于自化2);对于每个待 测样品，只需测定一个单链序列，因而它也就更快和更准确。
相比之下，间接测序为 了区别在PCR反应过程中由DNA聚合酶引入的随机错朽核苷酸所引起的原始基因组序列 中的突变，以及由体外重组而产生的人工扩增产物，如产生镶嵌等位基因(混合克隆) 等，每个样品不得不测定几个PCR产物克隆的序列。
不需借助在细菌中克隆就可直接获得清蜥和准确的序列结果，其难易程度取决 于:1)只扩增靶序列的PCR引物的扩增能力(通常称为PCR特异性);2用以获笪测序模板 的方法。与引物物异性及模板制备有关的问题将在下面谈到。虽然DNA测序的化学法 (Maxam-Gilbrt)可以用来直接测序，但我们这里仅讨论Sanger的末端终止法。
最佳的PCR条件
PCR反应的特异性在很大程度上是由寡聚核苷酸引物的序列所决定的。对于特定 的引物组，PCR的特异性可以由于采用最佳的反应条件、退火温度和PCR缓冲液中的 MgCl2浓度而发生明显的变化。
如果用标准的1.5mM的MgCl2浓度不能得到所需的特异 性PCR产物，我们建议MgCl2的终浓度为1.4∽2.5mM之间，以0.2mM增长率来改变MgCl2 浓度，以选择最佳Mg++浓度。一个较常遇见的问题是，使PCR特异性达到最高的MgCl2 浓度导致PCR扩增失败(dropouts)。
这可能是由于模板DNA溶液中有较高的EDTA，它隆 低了提供给Taq DNA聚合酶MgCl2量。因此，对于扩增溶解在TE(1mM EDTA)中的DNA， 我们建议用含2.0mM的MgCl2 的PCR缓冲液。
PCR反应的温度范围包含有三个不同的恒定期:变性期、退火期和延伸期，还有它 们之间的过渡期。为了获得用于序列分析的模板或杂交探针的单链DNA，通常并不需 要改变参数。
凝胶纯化PCR扩增的靶序列
如果最佳PCR反应条件不能产生所需的特异性产物，可采用新的寡核苷酸重新进 行扩增，或用凝胶电泳来分离不同的PCR产物，而后再各自重新扩增进行序列分析。 长度不同的片段可以用琼脂糖凝胶电泳来分离:
1.片段大小在80-100bp时，可采用3%NuSieve1%普通琼脂糖或用聚丙烯酰胺胶来 分离。
2.从胶上切下含所南非PCR片段的薄片。
3.加入50∽100μlTE浸泡胶片，可反复冻融或放置几个小时使DNA从胶中扩散出 来。
4.取少量(1-5%)进行第二次扩增，为得到纯净单一的产物，用于第二次PCR扩增 的凝胶抽提物的量必须少于1ng。
5.现已发现琼脂糖含有抑制Tab聚合酶活的物质。因而，如需重新扩增供Tab聚合 酶测序用的片段，最好用丙烯酰胺电泳分离。
当用PCR引物扩增几个同样长度的相关序列时，如来自几个新近复制的基因，或 重复序列或保守的信号序列(conserved signal sequences)的同样显子，可以通过下 列两种不同方法来改进电泳分离。1).先用只切割某一模板的内切酶进行酶切，而后 电泳纯化完整的PCR产物。2).用可使核苷酸序列不同的扩增产物分开的电泳系统。下 一个部份将讨论此类系统中的变性甲酰胺梯度凝胶系统。采用方法一时，必须事先了 解在不同PCR产物中的内切酶位点。
杂合体的直接测序
当两个等位基因由于单一位点突变而产生差异时，用一个PCR引物直接进行测 序，能找出杂合位点。但是，带有几个点突变或短片段的插入/缺失的等位模板用PC R引物之一来直接测序，将产生复合序列带(compound sequencing ladders)。
有四种 方法可以确定几种点突在型并从杂合体中获得单个等位基因的序列:1).克隆分离不同 的模板;2).在测序之前，利用模板之间核苷酸序列的差异，用电泳技术分离不同的模 板;3).在测序反应中只启动一个等位基因;4).只扩增一个等位基因。
测序模板的制备
与PCR产物的直接测序有关的一些问题是变性后由于扩增片段的两条链可以迅速 结合起来，从而阻止了测序引物与它的互补序列退火，或阻止了引物──模板复合物 的延伸。在测序反应中，模板链重新结合使一小部份模析骖与测序从而弱化最终的测 序条带。为减少此问题，可用改进的标准双链DNA测序法或用PCR制备单链模板。
双链DNA模板
有两种不同方法用来制备测序用的模板，目前都已用来测定共价闭环双链质粒模 板的序列。用这些方法来进行PCR产物的测序通常是较困骓的，因为短的线性模板比 团环质粒的双链更易于重新结合。在这两种方法中，PCR片段可以由凝胶电胶或在电 泳前先进行旋转透析(Spin-dialysis)纯化。
1.在室温下，模板先在0.2M NaOH中变性5分钟，冰冻，加入0.4倍的5M醋酸铵 (pH7.5)来中和反应。立即用四体积的无水乙醇沉淀DNA。在合适的退火温度下，加入 测序缓冲引物。
2.在95℃下保温5分钟来变性模板，冰浴(或在干冰乙醇中)快速冷却离心管，以 减少链的重新结合。加入测序引物并使反应达到合适的温度。测序引物在变性前或后 加入都合适。
单链DNA模板
使用单链模板可以避免测序中链的重新结合。单链模板可以从双链DNA模板经链 分离凝胶中制备，或用PCR反应制备。大于500bp的单链DNA片段，可从琼脂糖凝胶中 分离笪到，但它不适合于更短的单链。制备单链DNA的另一种不同方法是在PCR反应中 使用一个生物素标记的引物，变性后的PCR产物经过一个亲合素柱而使两条链得到分 离，只有生物素标记的链才可结合到柱上。
然而，最简单的方法是用改进的PCR方 法，用此方法制备既定的单链DNA。在这个反应中(不对称PCR，asymmetric PCR)，在 开始的20-25个循环中，两个比率不对称的扩增引物产生出双链DNA，当限量的那个引 物耗光后，随后的5-10个循环就产生出ssDNA。单链DNA在约在25个循环后开始出现， 这时限量的引物也几乎耗尽。经过一个短暂快速上升后，ssDNA就开始如预期的那样 呈线性积累，这时反应中仅有一个引物存在。
各种比率的引物都以这种形式产生 ssDNA。一般对100μlPCR反应体系而言，引物比率为50pmo:0.5pmol，经过30个循环 后，大约可产生1-3pmol的ssDNA。ssDNA的产量可用下列几种方法来估计:a)。在PCR 反应中，除了加入正常数量的dDNA外，还加入32P-dNTP。取10%的反应产物在薄的3% NuSieve+1%普通琼脂糖凝胶中电泳，干燥并与胶片一起曝光。b).取5%的反应物来走 胶，转移到膜上，并用与ssDNA互补的寡核苷酸为探针杂交。
ssDNA不能用EB染色来定 量，因为ssDNA有形成二级结构的趋势且染料的插入在模板中是随机的。使用不对称 引物比例的扩增效率比两种引物均过量80-90%)的扩增效率低(70%)。在实验中，这可 通过增加PCR循环的次数来弥补。
若不对称的PCR反应不能产生足够数量的ssDNA，可 以试一试不同的引物比率;b).再加5-10个PCR循环;c).在最后五个循环中多加Tab聚合 酶(2U);d).试一下相反的不对称引物比率。有时，相反的不对称引物比率可能给出不 同产量的ssDNA。制备出的单链DNA用限量的那个PCR引物或用一个内引物来测序，并 应用常规方法进行掺入测序(incorporation sequencing)或标记引物测序。
制备出的 ssDNA链可能有一个不连续的5'-末端，但可能在靠近3'-末端不同位点处被切去，这 是由于延伸过程中终止过早所产生的。然而，对于测序反应中所使用的任何一种引 物，只有完整的ssDNA可以用作测序模板。
最近还报道了另一种方法制备单链核酸模板进行直接测序。这种方法包括在一个 PCR引物上加入噬菌体的启动子，转录出该PCR产物的RNA拷贝，再用反转录酶不测 序。但由于扩增反应后附加了一个酶促反应步骤和限于用反转录酶作为测序酶，这种 方法的应用受到很大的限制。
用不耐热DNA聚合酶进行PCR产物的测序
一些不耐热DNA聚合酶已经用来直接测序体外扩增的DNA。使用Klenow聚合酶，修 饰T7DNA聚合酶(测序酶)及反转录酶来测序。
用Taq聚合酶进行PCR产物的测序
Tab聚合酶除了用作PCR扩增外，它还是DNA测序的理想的酶。Tab聚合酶具有高度 的延伸能力(processivity)，较高的掺入速率，并可用一些核酶类似物如7-Deaza-2' -脱氧鸟苷-5'-三磷酸来解决DNA测序中的压缩问题。
除了这些与T7DNA聚合酶相同的 性质外，它有较高的热稳定性，使反应温度可达55-70℃，这可使大量的二级结构解 体。可是，对于dNTPs而言，它有一个相对高的Km值(≈10-20μM)并缺乏3'-外切酶活 性。
当dNTP浓度低于1μM时，它将产生错配和不正确的终止。琼脂和琼脂糖中都有 Tab聚合酶的抑制物，但这些可通过增加测序反应中Tab聚合酶的量(2U-10U)得到部分 解决。当测定克隆插入子的PCR产物序列时时，由噬菌体液裂解制备的靶基因中并不 含有从平板溶解出来的抑制物。
对带有强二级结构的DNA进行测序
带有强二级结构的DNA测序可能产生两个问题:1).由于Tab聚合酶不能完全延伸的 模板频率很高，因而降低了PCR的效率，2.).在测序反应中，压缩被测DNA序列的长 度。
研究结果表明:在PCR中使用Tab聚合酶(50-70℃)的高反应温度足够解决大部份短 的二级结构。但强的二级结构会产生强烈的抑制作用。这些只能通过加入与dGTP比例 事适的碱基类似物c7dGTP后，才可解决。
同样的碱基类似物也可用在测序反应中，来 解决压缩问题(compression problem)。Tab聚合酶可以有效地掺入c7dGTP，但不能用 次黄嘌吟核苷作为碱基类似物。同样的碱基类似物也可用在测序反应中，来解决压缩 问题（COMPRESSION）。Tab聚合酶可以有效地掺入c7dGTP，但不能用次黄嘌呤核苷作 为碱基类似物。
PCR扩增DNA测序中涉及到的错误
在原始靶基因序列和由它扩增出的PCR产物之间可能有两种不一致情况:1).由点 突变引起的差异;2).由体外重组的等位基因引起的差异。点突变引起的差异是由于 每”个循环中每个核苷酸大约有2×10-4 几率发生错误掺入。经过30个循环扩增后，每 个PCR产物平均在每400-4000个碱基对内存有差异。
这个错误掺入的几率有时比 Klenow聚合酶(8×10-5 )更高。体外重组产生的等位基因(shuffle clone)j是镶嵌PCR 产物，这可能是在以后的循环中由部分延伸的PCR产物造成的，因为它可作为另一个 等位基因模板的引物。由于酶量不足以用来延伸所有的模板，使得在以后的反应循环 中主要积累这些等位基因。
除非杂合体中的两个等位基因在其PCR引物上有几个不同 位点的差异，这些人工产物进不能检测出来的。
当用PCR产物来克隆、测序并从一组相同克隆子序列(consensus sequence)推断 出各个等位基因的序列时，就必须考虑到这两种不同类型的错误。相比之下，当PCR 产物用来直接测序时，由错误掺入或镶嵌而产生的错误PCR产物并不影响PCR测序。
在 各个PCR产物中由点突变引起的差异与相同序列比是检测不出的。既使这个突变(如错 误掺入)在以一个DNA分子为模板的如单个精子DNA扩增反应的第一个循环中产生，它 也仅占该位点正常核苷酸的25%。
对起始DNA模板不止一个的扩增反应，在任一位点上 含有一个错配核苷酸的PCR产物的频率低到检测不出的程度。虽然目前并不很了解镶 嵌基因形成的条件，但相信这些等位基因是在反应最后几个循环中积累起来的，因为 这时酶量可能不足以用来延伸所有的模板。除非序列中有非常强烈的二级结构，在某 一特定位点上使链延伸终止，结果产生一个单一的人工基因。镶嵌基因不会影响正常 序列的测定。
测序反应的自动化
DNA测序的可重复性使它适合于完全或部分自动化。已有用常规的放射性标记引 物，或荧光终止标记或测序引物进行自动化测序的一系列仪器。但是，这些仪器仅使 分析的前半部分自动化，凝胶电泳、读带和将序列输到计算机中用后半部分自动化来 补足。
前半部有两个阶段:模板的制备测序模反应，可很容易地进行自动化反应。用 Tab酶进行PCR扩增和直接测序是制备测序模板和测序反应终产物的最有效方法。一旦 使用自动进样器，就可进行自动化反应，仅电泳分析由人工进行。这对许多一直使用 人工电泳测序反应的实验室来说，都将从中受益。
