重组克隆筛选(酶切鉴定)
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实验八 重组克隆筛选(酶切鉴定) |
【实验目的】 |
1.掌握质粒提取的基本方法的原理;
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【实验原理】 |
重组克隆的筛选和鉴定是基因工程中的重要环节之一。不同的克隆载体和相应的宿主系统,其重组克隆的筛选和鉴定方法不尽相同。从理论上说,重组克隆的筛选是排除自身环化的载体、未酶解完全的载体以及非目的DNA片断插入的载体所形成的克隆。常用的筛选方法有两类。一类是针对遗传表型改变筛选法,以?-半乳糖苷酶系统筛选法为代表。另一类是分析重组子结构特征的筛选法,包括快速裂解菌落鉴定质粒大小、限制酶图谱鉴定、Southern 印迹杂交、PCR、菌落(或噬菌斑)原位杂交等方法。
2.快速裂解菌落鉴定质粒大小
3.限制酶图谱鉴定
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【试剂与器材】 |
(一)试剂
(二)器材
(三)菌株
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【操作方法】 |
1. 质粒提取步骤(见实验五)
2)混匀反应体系后,将EP管置于适当的支持物上(如插在泡沫塑料板上),37℃水浴保温2h-3h,使酶切反应完全。
3)每管加入2μL 0.1mol/L EDTA (pH8.0),混匀,以停止反应,或置65℃水浴中10min,对限制性内切酶进行灭活,不同的酶灭活条件可能不同,可参照说明书进行。灭活后的酶切溶液置于冰箱中保存备用。
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【注意事项与提示】 |
1.影响
限制性内切酶
活性的因素包括:
2.市售的酶一般浓度很大,为节约起见,使用时可事先用酶反应缓冲液(1×)进行稀释;可采取适当延长酶切时间或增加酶量的方式提高酶切效率,但内切酶用量不能超过总反应体积的10%,否则,酶活性将因为甘油过量受到影响。 3.由于EDTA的存在会抑制 连接酶 的活性,通常采用加热方法终止酶切反应。 4.酶切反应的整个过程应注意枪头的洁净以避免造成对酶的污染,为防止酶活性降低,取酶时应在冰上操作且动作迅速。 |
【实验安排】 |
第三天观察转化结果(蓝白斑情况),计算重组率。提取重组质粒DNA、酶切鉴定。 |
【实验报告要求与思考题】 |
1.提交重组质粒酶切
琼脂
糖凝胶电泳检测结果。
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