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人基因组DNA的提取

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一、实验目的
掌握人外周血基因组DNA的抽提方法。

二、实验原理
从不同组织细胞或血细胞中提取高质量的DNA是进行基因诊断的先决条件。制备高质量DNA的原则是:①将蛋白质、脂类、糖类等物质分离干净;②尽可能保持DNA分子的完整。
在提取DNA的反应体系中,蛋白酶K为广谱蛋白酶,其主要特征是能在SDS和EDTA存在的情况下保持很高的活性,可将蛋白质降解成小的多肽和氨基酸。SDS是离子型表面活性剂,主要作用是:①破坏细胞膜及核膜;②解聚细胞中的核蛋白;③与蛋白质结合,使蛋白质变性而沉淀下来;④抑制DNA酶活性,使DNA分子尽量完整地分离出来。

三、实验用品和材料
(一) 试剂
    1.抗凝剂:EDTA 2%(W/V)生理盐水抗凝剂。称取2g EDTANa2、0.85g NaC1,加双蒸水至100m1。1ml该 试剂 可抗10ml全血凝结;亦可用医用人ACD抗凝剂抗凝。肝素能抑制限制性内切酶活性,因此一般不用肝素抗凝。
    2.15mmo1/L Tris-HCl(pH8.0),15 mmo1/L EDTA(pH8.0),15 mmo1/L NaCl (简称TES溶液);用lmo1/L Tris-HCl(pH8.0),0.5 mmo1/L EDTA(pH8.0),3mo1/L NaCl稀释成15 mmo1/L TES溶液。
    3.10%(W/V)SDS。
    4.15mmo1/L TES饱和酚,重蒸酚在热水浴(100℃)中溶化后加入1/3体积的15 mmo1/L TES溶液,充分混匀后,放冰箱中静置6h以上。酚层在下,水层在上。吸掉上层多余的TES溶液,冰箱中避光保存备用。为防止酚被氧化成酮,可加少量8-羟基喹啉(2 mmo1/L~5mmo1/L)。
    5.氯仿/异戊醇(24:1,V/V),现配现用。
    6.蛋白酶K。
    7.10mmo1/L Tris-HCl,1mmo1/L EDTA(pH7.5)(简称TE溶液)。用1mo1/L Tris-HCl(pH7.5),0.5mo1/L EDTA(pH 7.5~8.0)稀释配制。
(二)用品:Eppendorf试管、 离心管 、吸管、加样器、枪头、离心机、水浴箱、紫外分光光度计、电泳仪、电泳槽。

四、实验方法和步骤
1.白细胞的分离
    (1)抗凝血用1~2倍的生理盐水或磷酸缓冲的生理盐水(PBS)稀释并混合。
    (2)在50ml 离心管 中加入1倍体积淋巴细胞分离液(上海试剂二厂),在上面仔细铺一层2倍体积已稀释的血液。
    (3)室温以2000rpm离心15min~20min,红细胞应沉于管底,而白色的淋巴细胞应分布于上层血浆与下层淋巴细胞分离液的界面。
    (4)吸弃血浆,小心吸取淋巴细胞层,直至把淋巴细胞转移完全。
    (5)用生理盐水或PBS洗淋巴细胞二次。
    (6)最后得到的淋巴细胞沉淀,可立即用于DNA的提取,或冻存于超低温冰箱中,直至使用。
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