大肠杆菌非中断杂交实验

一、 实验目的
1．了解细菌有性杂交的原理，学习合作实验，熟悉点菌。
2．掌握利用非中断杂交法进行基因定位的原理，并利用实验结果进行分析。
二、 实验原理
F ⁺ 菌株：带有F因子的菌株
F ^- 菌株：不带F因子的菌株
Hfr品系：F因子整合入细菌染色体
F’菌株：由Hfr菌株染色体中F因子的不正常环出造成F’因子含有供体细胞的特定基因
其中，带有F因子的菌株能够与不带F因子的菌株（F ^- 菌株）进行杂交进而发生基因重组。F因子一般游离于细菌染色体之外，也可能整合到染色体上，因此是一种被称为附加染色体的质粒。带有F因子的细菌，细胞表面会形成一种与细胞接合作用相关的毛状突起，被称为性纤毛，长约1-20μm。性纤毛促使供体和受体细胞特异地配对，在受体细胞上有纤毛的特异结合位点，当性纤毛结合到这些特异性位点之后，开始收缩并将2个细菌拉拢形成作为遗传物质转移通道的接合管，遗传物质的转移就开始了。
F ⁺ 菌株和F ^- 菌株杂交发生基因重组的频率约为10 ^-7 ； Hfr品系，其和F ^- 菌株杂交时发生重组的频率为10 ^-4 ；通过F’因子介导的供体菌向受体菌特定基因的转移被称为性导。
在杂交过程中，接合细菌可以在2小时中缓慢地进行遗传物质的传递，在杂交不同时间进行强力搅拌，打断接合细菌之间的接合管，从而终止遗传物质的转移。所以对应于转移起点越近的基因进入受体菌的几率越大，因此可以通过绘制基因的转移曲线推断出基因顺序并以时间为单位进行染色体作图，这种方法就是中断杂交作图。
本实验采用的是非中断杂交，不同的高频重组品系（Hfr）中F因子与主染色体的整合位置是不同的。Hfr菌株与F ^- 菌株进行结合，染色体由Hfr向F ^- 转移，由于染色体的转移是单方向性的，染色体上的基因都是连锁的，所以，位于Hfr染色体上前面的基因将有更多的机会出现在F ^- 中，越是后端的基因出现的机会就越少。因此，根据细菌结合后F ^- 菌中Hfr上的基因出现的多少就可以测定基因间的相对位置。实验中采用选择培养基筛选法，即亲本不能生长，只有重组子可以生长，同时可利用营养物的加入选择不同的重组子。
三、   实验用具及材料
1）菌株
供体菌：E.coli CSH60 Hfr str ^s
受体菌：E.coli 57B F ^- 缺陷型
met-leu-trp-his-arg-lac-gal-ade-ilv-str ^r   
2）实验 试剂 及培养基
1．液体BP培养基，10×A磷酸缓冲液 ，生理盐水 ，200.0g/L糖溶液，0.25M硫酸镁溶液，盐酸硫胺素（VBI），链霉素溶液，氨基酸溶液及腺嘌呤
2．平板培养基：见表 1。
表 1培养基配表

培养基	选择标记	碳源	Str	Arg	Ilv	Met	Leu	Ade	Trp	His
A	met leu str	葡萄糖	＋	＋	＋	－	－	＋	＋	＋
B	arg (met leu str)	葡萄糖	＋	－	＋	－	－	＋	＋	＋
C	ade (met leu str)	葡萄糖	＋	＋	＋	－	－	－	＋	＋
D	trp (met leu str)	葡萄糖	＋	＋	＋	－	－	＋	－	＋
E	his (met leu str)	葡萄糖	＋	＋	＋	－	－	＋	＋	－
F	lac (met leu str)	乳糖	＋	＋	＋	－	－	＋	＋	＋
G	gal (met leu str)	半乳糖	＋	＋	＋	－	－	＋	＋	＋

将培养基配制完成后，在超净工作台将培养基倒入培养皿内制成平板，待培养基冷凝后备用。