DNA的琼脂糖凝胶电泳实验原理和方法步骤
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一、实验目的
学习和掌握琼脂糖电泳法鉴定DNA的原理和方法。
二、实验原理
琼脂糖凝胶电泳是用于分离、鉴定和提纯DNA片段的标准方法。琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖，具亲水性，但不带电荷，是一种很好的电泳支持物。DNA在碱性条件下（pH8.0的缓冲液）带负电荷，在电场中通过凝胶介质向正极移动，不同DNA分子片段由于分子和构型不同，在电场中的泳动速率液不同。溴化乙锭（EB）可嵌入DNA分子碱基对间形成荧光络合物，经紫外线照射后，可分出不同的区带，达到分离、鉴定分子量，筛选重组子的目的。
三、实验材料
实验14提取的DNA样品，
四、器具及药品
电泳仪，电泳槽，紫外透射反射仪，恒温 水浴 锅，微波炉，微量进样器，三羟甲基氨基甲烷，盐酸，醋酸钠，EDTA，琼脂糖，溴酚蓝，溴化乙锭。
五、实验步骤
1、安装电泳槽
将有机玻璃的电泳凝胶床洗净，晾干，用胶带将两端的开口封好，放在水平的工作台上，插上样品梳。
2、琼脂糖凝胶的制备
称取琼脂糖溶解在电泳缓冲液中，（按0.3-1.5%的琼脂糖含量，1-25kb大小的DNA用1%的凝胶，20-100kb的DNA用0.5%的凝胶，200-2000bp的DNA用1.5%的凝胶）置微波炉或沸 水浴 中加热至完全溶化（不要加热至沸腾），取出摇匀。
3、灌胶
将冷却到60℃的琼脂糖溶液轻轻倒入电泳槽水平板上。
4、待琼脂糖胶凝固后，在电泳槽内加入电泳缓冲液，然后拔出梳子。
5、加样
将DNA样品与加样缓冲液按4：1混匀后，用微量 移液器 将混合液加到样品槽中，每槽加10-20μl，记录样品的点样次序和加样量。
6、电泳
安装好电极导线，点样孔一端接负极，另一端接正极，打开电源，调电压至3-5V/cm，电泳1-3hr，当溴酚蓝移到距凝胶前沿1-2cm时，停止电泳。
7、染色和观察
取出凝胶，放在含有溴化乙锭的染色液中染色30min，即可在254nm的紫外灯下观察，有橙红色荧光条带的位置，即为DNA条带，或在紫外灯下照相记录电泳图谱。溴化乙锭是致癌剂，操作时要小心，必须戴手套。
附：
⑴5×TBE（tris-硼酸及 EDTA ）缓冲液的配制(1000ml)：
Tris 54g，硼酸27.5g，0.5mol/L EDTA 20ml，将pH调到8.0，定容至1000ml，4℃冰箱保存，用时稀释10倍。
⑵加样缓冲液的配制：
0.25%溴酚蓝，40%（W/V）蔗糖水溶液，4℃冰箱保存。
⑶溴化乙锭的配制：
称取0.1g溴化乙锭，溶于10ml水，配成终浓度为10mg/ml的母液，4℃冰箱保存。染色时，吸取12.5μl的母液，加入250ml的水中，使其终浓度为0.5μg/ml，混合均匀。
⑷100倍TE缓冲液的配制：
1mol/L Tris -HCl（pH8.0），100mmol/LEDTA
称取 Tris 121.1g，EDTA-Na 2 37.23g，先用800ml双蒸水，加热搅拌溶解后，再用盐酸调pH至8.0（大约加入盐酸20ml），然后定容至1000ml。
⑸100倍电泳 缓冲液 的配制：
4mol/LTris-HCl（pH8..0），2mol/L醋酸钠，200mmol/LEDTA
称取Tris242.2g，无水乙酸钠82.03g，EDTA-Na 2 37.23g，先用400ml双蒸水加热搅拌溶解后，再用冰乙酸调pH至8.0（大约加入冰乙酸50ml），然后定容至500ml。用时稀释100倍。
学习和掌握琼脂糖电泳法鉴定DNA的原理和方法。
二、实验原理
琼脂糖凝胶电泳是用于分离、鉴定和提纯DNA片段的标准方法。琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖，具亲水性，但不带电荷，是一种很好的电泳支持物。DNA在碱性条件下（pH8.0的缓冲液）带负电荷，在电场中通过凝胶介质向正极移动，不同DNA分子片段由于分子和构型不同，在电场中的泳动速率液不同。溴化乙锭（EB）可嵌入DNA分子碱基对间形成荧光络合物，经紫外线照射后，可分出不同的区带，达到分离、鉴定分子量，筛选重组子的目的。
三、实验材料
实验14提取的DNA样品，
四、器具及药品
电泳仪，电泳槽，紫外透射反射仪，恒温 水浴 锅，微波炉，微量进样器，三羟甲基氨基甲烷，盐酸，醋酸钠，EDTA，琼脂糖，溴酚蓝，溴化乙锭。
五、实验步骤
1、安装电泳槽
将有机玻璃的电泳凝胶床洗净，晾干，用胶带将两端的开口封好，放在水平的工作台上，插上样品梳。
2、琼脂糖凝胶的制备
称取琼脂糖溶解在电泳缓冲液中，（按0.3-1.5%的琼脂糖含量，1-25kb大小的DNA用1%的凝胶，20-100kb的DNA用0.5%的凝胶，200-2000bp的DNA用1.5%的凝胶）置微波炉或沸 水浴 中加热至完全溶化（不要加热至沸腾），取出摇匀。
3、灌胶
将冷却到60℃的琼脂糖溶液轻轻倒入电泳槽水平板上。
4、待琼脂糖胶凝固后，在电泳槽内加入电泳缓冲液，然后拔出梳子。
5、加样
将DNA样品与加样缓冲液按4：1混匀后，用微量 移液器 将混合液加到样品槽中，每槽加10-20μl，记录样品的点样次序和加样量。
6、电泳
安装好电极导线，点样孔一端接负极，另一端接正极，打开电源，调电压至3-5V/cm，电泳1-3hr，当溴酚蓝移到距凝胶前沿1-2cm时，停止电泳。
7、染色和观察
取出凝胶，放在含有溴化乙锭的染色液中染色30min，即可在254nm的紫外灯下观察，有橙红色荧光条带的位置，即为DNA条带，或在紫外灯下照相记录电泳图谱。溴化乙锭是致癌剂，操作时要小心，必须戴手套。
附：
⑴5×TBE（tris-硼酸及 EDTA ）缓冲液的配制(1000ml)：
Tris 54g，硼酸27.5g，0.5mol/L EDTA 20ml，将pH调到8.0，定容至1000ml，4℃冰箱保存，用时稀释10倍。
⑵加样缓冲液的配制：
0.25%溴酚蓝，40%（W/V）蔗糖水溶液，4℃冰箱保存。
⑶溴化乙锭的配制：
称取0.1g溴化乙锭，溶于10ml水，配成终浓度为10mg/ml的母液，4℃冰箱保存。染色时，吸取12.5μl的母液，加入250ml的水中，使其终浓度为0.5μg/ml，混合均匀。
⑷100倍TE缓冲液的配制：
1mol/L Tris -HCl（pH8.0），100mmol/LEDTA
称取 Tris 121.1g，EDTA-Na 2 37.23g，先用800ml双蒸水，加热搅拌溶解后，再用盐酸调pH至8.0（大约加入盐酸20ml），然后定容至1000ml。
⑸100倍电泳 缓冲液 的配制：
4mol/LTris-HCl（pH8..0），2mol/L醋酸钠，200mmol/LEDTA
称取Tris242.2g，无水乙酸钠82.03g，EDTA-Na 2 37.23g，先用400ml双蒸水加热搅拌溶解后，再用冰乙酸调pH至8.0（大约加入冰乙酸50ml），然后定容至500ml。用时稀释100倍。
