DNA测序技术概述 The Overview of DNA Sequencing Technology
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[摘 要] DNA测序技术作为现代生命 科学研 究的核心技术之 一，自上世纪 70年代 中期 DNA发 明以来发展迅速 。我 们简要综述现有的几代 DNA测序技术的原理及其发展历程 ，并对未来可能出现 的第三代测序进行预测。
[关键词 ] DNA测序；新一代 测序 ；单分子测序 ；直接测序
The Overview ofDNA Sequencing Technology
ZHAN Ai-Yao，LUO Pei-Gao
College ofAgircultural，Sichuan AgriculturalUniversity，Ya'an 625014，China [Abstract] DNA sequencingtechnologyasoneofthecoretechnoloyg ofmodem lifescienceresearchhasquickly developed since itsestablishing，the mid一1970s．In thisarticle we mainly summairzed the currently existingseveral generation DNA sequencing technologies，itsevolution，and predicted the third generation sequencing may be apperarin the future．
[Key words] DNA sequencingtechnoloyg；nextgenerationsequencing；singlemoleculesequencing；directDNA sequencing
1944年 ，Avery通过肺炎双球菌转化实验证 明 DNA是遗传信息的载体f1]。此后 ，人们一直致力于 DNA结构和序列研究 ，使得 DNA测序技术应运而 生[2-5]。该技术对探索生命奥秘、治疗疾病 ，以及整个 生物科学乃至医学 的发展起到了巨大的推动作用 ， 并具有广阔的应用前景。
DNA测序技术的发展经历了几个重要阶段 ：① 经典 的手工测序 ，主要依赖于一些生物化学方法和 电泳分离技术 ，包括 Sanger测序和 DNA化学降解 测序 ；②第一代测序技术 ，主要基于 Sanger法 的测 序原理 ，结合荧光标记和毛细管 阵列电泳技术来实 现测序 的 自动化 ；⑧第二代测序平 台，又称为新一 代测序技术 ，主要包括 Solexa测序 、Solid平 台、454 测序 、HeliScope遗传分析系统等 ，它们 的测序原理 不完全相 同，但共同的特点是都不需要传统 的克隆 步骤 ，实现了更高的通量。目前 ，该技术仍在发生着 迅速 的变化 ，它的发展使人们对遗传物质 DNA的 认识层次不断升华 ，从对单一 、局部 的基 因或基 因 片段的研究转变成了对整个基因组 的研究【q。我们 主要 回顾了这几代 DNA测序技术 的发展历程 ，并 对未来可能出现的第三代测序进行了预测 。
1 经典的 DNA测序 方法
2O世纪 70年代 中期 ，2种不 同的 DNA测序方 法几乎同时发表 ：Sanger等提出 “DNA双脱氧链末 端 终止 测 序 ”，又称 Sanger测 序 ；Maxam 等提 出 “DNA化学降解测序” 。前者是利用 DNA聚合酶 I的聚合反应 ，在反应体 系中引入一定 比列 的 2， 3一双脱氧核苷 三磷酸 (ddNTP)作 为终止 剂 ，由于 DNA多聚酶不能 区分 dNTP和 ddNTP，因此 ddNTP 可 以掺入新生单链中 ，而 ddNTP的核糖基 3碳原 子上连接的是氢原子而不是羟基 ，因而不能与下一 个核苷酸聚合延伸 ，合成的新链在此终止，终止点 由 反应中相应的双脱氧核苷酸三磷酸而定 。后者的测 序原理是在选定 的核苷酸碱基 中引入化学基团 ，经 过化合物处理使 DNA分子在被修饰 的核苷酸位置 降解 。虽然这 2种测序方法的原理不同，但它们都是 根据核苷酸在某一固定的点起始，随机在某一特定 碱基处终止 ，形成一系列 以某一特定脱氧核糖核苷酸(A、T、C、G)为末端的长度各异的寡聚脱氧核糖核 苷酸混合物 ，然后通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺 凝胶电泳 ，经放射 自显影后 ，直接从胶片上读 出 DNA 的顺序 。
这 2种测序方法都要 依赖放射性 同位素标记 ( ，S)来 实现 ，操作步骤繁琐 ，难 以 自动化 ，不 能 满足大规模测序的要求 。因此 ，科研人员开始寻求 新的非放射性标记 的测序技术来克服这些缺点。
2 第一代 DNA测序技 术
2．1 第一代半 自动 DNA测序
2O世纪 80年代末 ，荧光标记 的测序技术逐渐 取代 同位素标记测序 ，四色荧光标记的应用使测序 反应物的分离能在一个泳道完成 ，从而降低了泳道 间迁移率的差异对测序精度的影响 ，为一块平板胶 做 96个样 品的高密度电泳的发展奠定了基础[71。此 时 ，基于凝胶平板电泳的第一代半 自动 DNA测序 仪应运而生[81，如 ABI公司首次推 出的 ABI370半 自动测序仪 ，其原理是采用 4种具有不同发射波长 的荧光染料标记 由聚合酶链终止反应产生 的一 系 列终止片段 ，经过聚丙烯酰胺凝胶 电泳分离后 ，利 用激光对分离 的 DNA片段携带的荧光信号进行激 发 ，然后检测并记 录不 同发射波长 的信号 ，经计算 机处理 ，最后得到 DNA序列信息【9]。这种方法免除 了同位素标记必须 同时进行 4组反应的麻烦 ，而且 简化为 由 1条泳道 同时读 出 4种碱基 ，大大提高了 测序速度 ，为 自动化加样及计算 机阅读提供 了技术 基础 ，为基 因组大规模i贝4序提供 了可能 。但 这种测 序技术仍 然使用平板凝胶电泳技术 ，费时费力 ，分 析容量较低 ，提供的信息较少 。
[关键词 ] DNA测序；新一代 测序 ；单分子测序 ；直接测序
The Overview ofDNA Sequencing Technology
ZHAN Ai-Yao，LUO Pei-Gao
College ofAgircultural，Sichuan AgriculturalUniversity，Ya'an 625014，China [Abstract] DNA sequencingtechnologyasoneofthecoretechnoloyg ofmodem lifescienceresearchhasquickly developed since itsestablishing，the mid一1970s．In thisarticle we mainly summairzed the currently existingseveral generation DNA sequencing technologies，itsevolution，and predicted the third generation sequencing may be apperarin the future．
[Key words] DNA sequencingtechnoloyg；nextgenerationsequencing；singlemoleculesequencing；directDNA sequencing
1944年 ，Avery通过肺炎双球菌转化实验证 明 DNA是遗传信息的载体f1]。此后 ，人们一直致力于 DNA结构和序列研究 ，使得 DNA测序技术应运而 生[2-5]。该技术对探索生命奥秘、治疗疾病 ，以及整个 生物科学乃至医学 的发展起到了巨大的推动作用 ， 并具有广阔的应用前景。
DNA测序技术的发展经历了几个重要阶段 ：① 经典 的手工测序 ，主要依赖于一些生物化学方法和 电泳分离技术 ，包括 Sanger测序和 DNA化学降解 测序 ；②第一代测序技术 ，主要基于 Sanger法 的测 序原理 ，结合荧光标记和毛细管 阵列电泳技术来实 现测序 的 自动化 ；⑧第二代测序平 台，又称为新一 代测序技术 ，主要包括 Solexa测序 、Solid平 台、454 测序 、HeliScope遗传分析系统等 ，它们 的测序原理 不完全相 同，但共同的特点是都不需要传统 的克隆 步骤 ，实现了更高的通量。目前 ，该技术仍在发生着 迅速 的变化 ，它的发展使人们对遗传物质 DNA的 认识层次不断升华 ，从对单一 、局部 的基 因或基 因 片段的研究转变成了对整个基因组 的研究【q。我们 主要 回顾了这几代 DNA测序技术 的发展历程 ，并 对未来可能出现的第三代测序进行了预测 。
1 经典的 DNA测序 方法
2O世纪 70年代 中期 ，2种不 同的 DNA测序方 法几乎同时发表 ：Sanger等提出 “DNA双脱氧链末 端 终止 测 序 ”，又称 Sanger测 序 ；Maxam 等提 出 “DNA化学降解测序” 。前者是利用 DNA聚合酶 I的聚合反应 ，在反应体 系中引入一定 比列 的 2， 3一双脱氧核苷 三磷酸 (ddNTP)作 为终止 剂 ，由于 DNA多聚酶不能 区分 dNTP和 ddNTP，因此 ddNTP 可 以掺入新生单链中 ，而 ddNTP的核糖基 3碳原 子上连接的是氢原子而不是羟基 ，因而不能与下一 个核苷酸聚合延伸 ，合成的新链在此终止，终止点 由 反应中相应的双脱氧核苷酸三磷酸而定 。后者的测 序原理是在选定 的核苷酸碱基 中引入化学基团 ，经 过化合物处理使 DNA分子在被修饰 的核苷酸位置 降解 。虽然这 2种测序方法的原理不同，但它们都是 根据核苷酸在某一固定的点起始，随机在某一特定 碱基处终止 ，形成一系列 以某一特定脱氧核糖核苷酸(A、T、C、G)为末端的长度各异的寡聚脱氧核糖核 苷酸混合物 ，然后通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺 凝胶电泳 ，经放射 自显影后 ，直接从胶片上读 出 DNA 的顺序 。
这 2种测序方法都要 依赖放射性 同位素标记 ( ，S)来 实现 ，操作步骤繁琐 ，难 以 自动化 ，不 能 满足大规模测序的要求 。因此 ，科研人员开始寻求 新的非放射性标记 的测序技术来克服这些缺点。
2 第一代 DNA测序技 术
2．1 第一代半 自动 DNA测序
2O世纪 80年代末 ，荧光标记 的测序技术逐渐 取代 同位素标记测序 ，四色荧光标记的应用使测序 反应物的分离能在一个泳道完成 ，从而降低了泳道 间迁移率的差异对测序精度的影响 ，为一块平板胶 做 96个样 品的高密度电泳的发展奠定了基础[71。此 时 ，基于凝胶平板电泳的第一代半 自动 DNA测序 仪应运而生[81，如 ABI公司首次推 出的 ABI370半 自动测序仪 ，其原理是采用 4种具有不同发射波长 的荧光染料标记 由聚合酶链终止反应产生 的一 系 列终止片段 ，经过聚丙烯酰胺凝胶 电泳分离后 ，利 用激光对分离 的 DNA片段携带的荧光信号进行激 发 ，然后检测并记 录不 同发射波长 的信号 ，经计算 机处理 ，最后得到 DNA序列信息【9]。这种方法免除 了同位素标记必须 同时进行 4组反应的麻烦 ，而且 简化为 由 1条泳道 同时读 出 4种碱基 ，大大提高了 测序速度 ，为 自动化加样及计算 机阅读提供 了技术 基础 ，为基 因组大规模i贝4序提供 了可能 。但 这种测 序技术仍 然使用平板凝胶电泳技术 ，费时费力 ，分 析容量较低 ，提供的信息较少 。
