丁香实验_LOGO
登录
提问
提问
我要登录
|免费注册
丁香通
点赞
收藏
wx-share
分享

逆向方法在生物分离过程的新应用

互联网

552
用非常规的逆向方法,可迫使酵母遗传筛选中的蛋白质相互作用,研究者由此可以鉴别出参与 生物 反应过程的因子。

将传统方法倒转过来使用,有时会产生令人意想不到的结果。在华盛顿大学Stanley Fields实验室工作的Michael DeVit,当研究蛋白质之间相互作用的效果时,就遇到上述这种情况。双杂交筛选法可筛选出结合诱饵蛋白的蛋白质,DeVit 和Fields两人将这种方法倒转过来使用:他们先迫使蛋白质与诱饵结合,然后再筛选可以激活某一反应通道的蛋白(DeVit等人,2005)。事实证明,这种方法非常适合分离某些 生物 反应过程(如信号转导)中的成份

  这种方法的第一步是迫使蛋白质之间相互作用,从技术上来讲,这也是最具挑战性的步骤。DeVit选用了转录激活子Jun和Fos的亮氨酸拉链序列(该序列相互之间结合具有高度亲和性),将一段序列与他的诱饵结合,另一段序列与他的酵母蛋白文库结合。在这一体系的首次试验中,他将Jun-GFP作为诱饵,并将其与Fos蛋白文库结合。随着GFP在细胞中定位,DeVit可以识别目标蛋白的胞内位点。虽然这仅为筛选 膜蛋白 提供了基础条件,但DeVit和Fields的真正目的在于识别信号转导通道的成份

  他们将注意力集中在与菌丝生长有关的一种酵母MAP 激酶 通道上。利用Jun和Msb2融合、MAP 激酶 信号级联启动子、Fos标记的蛋白文库,DeVit对酵母进行转化。某些文库蛋白与Msb2相互作用时可激活通道,这样的文库蛋白能启动信号,而信号启动导致了酵母生长;另一些文库蛋白与Msb2相互作用时未正常结合,这样的蛋白质则不能启动信号,相应地也不能使酵母生长。采用这种筛选方法,他们识别出了一种先前未知的、与Msb2信号启动有关的酵母蛋白。值得注意的是,这种酵母蛋白包含一个可影响蛋白质降解的肽基元,这一发现将有助于对通道进行调控,目前该发现正处于研究中。Fields指出,这要求人们既要注意这种试验方法的强度(识别新的参与生物反应过程的因子),也要注意它的潜在风险。他提醒说:“因为这项研究具有人为性,你并不能确定你所做的一切,在生物体内都是必须的、有意义的,所以你必须进行其他的相关研究

  尽管这种试验方法仅对蛋白质进行了初筛选,但它的应用前景依然广阔。说到实例,Fields认为:“几乎对于所有的生物反应过程来说,如信号启动、转录、DNA复制、蛋白转运等等,你都能找到一种可以安置拉链的关键蛋白,然后将其他所有蛋白连接到这个位点,看看会有什么情况发生。”他补充道,“这种方法应用的有效性,只受到你所提供的生物反应细胞数量的限制。”由于仅仅受限于科学家的想象力,这种试验方法可能在探索蛋白网络复杂的信息交换方面有着广泛的应用。

提问
扫一扫
丁香实验小程序二维码
实验小助手
丁香实验公众号二维码
关注公众号
反馈
TOP
打开小程序