丁香实验_LOGO
登录
提问
我要登录
|免费注册
点赞
收藏
wx-share
分享

免疫PCR基本概念

互联网

2148
免疫PCR主要由两个部分组成,第一部分的免疫反应类似于普通的酶联免疫吸附试验(ELISA)的测定过程;第二部分即通常的PCR检测,抗原分子的量最终由PCR产物的多少来反映。第一步中,首先用待测抗原(如牛血清白蛋白(ESA))包被微滴板孔,再加入相应的特异抗体,于是抗体就与固相上的抗原结合形成抗原抗体复合物,蛋白A-链亲合素(Protein A-Streptavidin)嵌合体(重组融合蛋白)中的蛋白A部分可与固相上抗原抗体复合物中的抗体IgG结合,而链亲合素部分可与生物素化的pUC19(质粒DNA) (Biotin-pUC19)中的生物素反应,从而将特定的DNA间接吸附于固相。接下来,就是第二步中的PCR过程,第一步中吸附于固相的pUC19质粒DNA在相应的引物存在下,可经PCR在几小时内而放大数百万倍,PCR产物的多少与固相上抗原的量成正比。
 
PCR由 ①待测抗原;②生物素化抗体;③亲和素(连接分子);④生物素化DNA;⑤PCR扩增五部分构成。
 
1. 待检抗原
被检测的样品可以是抗原,或者是作为抗原的某种抗体。待检的抗原可以直接吸附于固相,这一过程与ELISA试验是相同的,因此有些吸附性差的抗原不能应用目前介绍的免疫PCR方法进行检测,需要对免疫PCR进行改进,以便能够检测吸附性差的抗原。免疫PCR的后续过程需PCR扩增,目前有些方法应用的固相板或管是特殊用于免疫PCR,并且有些PCR仅可以直接用微量板进行扩增,这样可以简化实验过程和提高检测的精确性。免疫PCR具有非常高的敏感性,特别适用于检测微量抗原。
 
2.  特异抗体
免疫PCR中的特异抗体是对应于待检抗原,与ELISA一样,抗体的特异性和亲合力将影响免疫PCR的特异性和敏感性。一般均选用单克隆抗体,这个抗体常采用生物素标记,通过亲和素再结合DNA。
 
3.  连接分子
连接分子是连接特异抗体与DNA之间的分子。目前介绍的方法中均是通过生物素与亲和素系统使特异抗体与DNA连接,生物素和亲和素作为免疫PCR的连接分子在连接方式上有许多差异。Sano首次报道PCR时用的是重组葡萄球菌A蛋白-亲和素嵌合蛋白(SPA-亲和素)。其具有结合IgG和生物素的两个位点,因此可以将IgG与生物素化的DNA连接成复合物。由于重组的SPA-亲和素没有商品试剂,且SPA不但可以结合特异抗体的IgG,而且还可以与样品中吸附于固相的无关IgG结合,特别是检测的抗原就是某种IgG,因此,Ruzicke认为Sano的免疫PCR本底高和特异性差。Ruzicke用商品化的亲和素系统试剂建立了一种免疫PCR,这种方法是先将亲和素与生物素化的DNA预结合成复合物,然后再与结合固相的特异性抗体结合,这种方法存在的问题是亲和素与生物素化的DNA分子预结合时二者的分子比例并不是等同的,一个亲和素分子可以结合4个分子生物素,因此在预结合时生物素化的DNA分子不能过多,否则DNA分子上的生物素将亲和素完全饱和,亲和素再无结合生物素化抗体的能力;但在低饱和生物素化DNA时,亲和素结合的生物素化DNA存在许多种类的复合物,甚至还有游离的亲和素,只有部分结合生物素化DNA的亲和素才能起到连接分子的作用,因此,这样预结合的亲和素和生物素化DNA是一均质性很差的混合物。虽然预结合的复合物可以减少测试过程中的1次孵育和冲洗,但是这样的复合物作为连接分子必然导致敏感性低和误差大,并且每次制备的连接分子均有差异,从而导致重复性差。
 
Hong zhou等建立了一种免疫PCR方法,连接分子是链亲和素,在连接抗体和DNA时是以游离的方式加入,这样链亲和素先与生物素化抗体结合,冲洗后,再加入生物素化的DNA。这个方法虽然多了1次孵育和冲洗过程,但具有较好的敏感性和重复性。
 
4.  生物素化DNA
免疫PCR中的DNA是一指示分子,用DNA聚合酶将结合于固相上的DNA特异放大,由此定量检测抗原。免疫PCR的敏感性高于ELISA主要是应用了PCR强大的扩增能力。免疫PCR中的DNA分子可以选择任何DNA,但要保证DNA的纯度,且有较好的均质性,尽可能不选用受检样品中可能存在的DNA。一般可选用质粒DNA或PCR产物等。DNA的生物素化是用生物素标记的dATP或dUTP通过DNA聚合酶标记在DNA分子上,一般是一个分子DNA标记两个生物素,标记率可达百分之百。生物素化的DNA用量需预先选定,过多易出现非特异结合而引起本底过高,过低将导致敏感性低和出现不同浓度抗原得出同样结果的饱和现象。
 
5.  PCR系统
免疫PCR的PCR扩增系统与一般PCR一样,主要包括引物、缓冲液和耐热DNA聚合酶。由于免疫PCR需用固相进行抗原抗体反应,同时又需要对固相结合的DNA进行扩增,因此,免疫PCR固相的选择应根据具体情况确定。用微量板作为固相必须有配套的PCR仪,以使可以用微量板直接扩增,否则需要用PCR反应管作为固相扩增后的PCR产物用琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,根据PCR产物的大小选择两种凝胶的浓度。电泳后凝胶经染色和拍照记录结果,再检测底片上PCR产物的光密度,并与标准品比较就可以得出待检抗原量。
 
提问
扫一扫
丁香实验小程序二维码
实验小助手
丁香实验公众号二维码
扫码领资料
反馈
TOP
打开小程序