LaVision双光子显微镜：多线扫描双光子成像

摘要：高空间分辨率和低的光损伤风险使得双光子激光扫描显微镜TPLSM成为生物功能成像的选择。但是，如神经钙离子调控等功能性动态研究通常也需要一个高的时间分辨率。目前，通过线扫描可以获取速度的提升，但是将结构的空间分辨率限制在一条轴上。为克服高空间分辨率和高时间分辨率间的空白，我们改进了TPLSM，使用一个多倍分光器来在样品中产生多个激光焦点。通过使用一个电子倍增相机检测这些焦点释放的荧光，它可以支持同时进行多条线扫描。除了多线扫描，高达64束的阵列也允许使用X-Y扫描模式去以高的帧速获取整幅图像。为估测多线扫描TPLSM在功能性原位成像中的应用，监测了苍蝇大脑中的视觉运动神经元中的钙离子信号。以分枝状轴突和棘突状结构的测量为例展示了我们的方法对于从不同细胞位置同时获取信号的能力。钙离子动态依赖于分支大小，但是“棘突”与他们的“母轴突”并没有系统性的区别。我们设备的空间分辨率与激光共聚焦显微镜进行了严格比较并通过运行成像和点扫描模式直接评估图像检测过程中释放光散射的负面效应。

Keywords: Two-photon; Microscopy; Calcium imaging; Temporal resolution;Beamsplitter; Visual system; Invertebrate
 

1.导论

调查单个神经细胞和神经回路内的动态过程通常要求对神经活动具有高时间分辨率和空间分辨率的成像。传统宽视野荧光显微镜对完整组织的空间分辨率受到光散射的严重影响。另一方面，时间分辨率受到CCD在弱光条件下获取图像所需时间的限制。
 

激光扫描显微镜尤其是TPLSM，在散射性组织中可能提供了比传统成像方式更高的空间分辨率，并允许基于不同焦平面的图像系列的三维重构(forreview see: Halbhuber and K¨onig, 2003; Helmchen and Denk, 2002; Wrightand Wright, 2002; Zipfel et al., 2003).激光扫描显微镜的更高的空间分辨率事实上取决于受到样品内激光焦点限制的信号检测（共聚焦显微镜）或激发本身（TPLSM）。
 

但是，成像速率是激光显微镜中的一个问题：例如，当激光沿着一个轴重复扫描时，只有在线扫描中，获取率通常可以上升到每秒几百个样品。相对而言，扫描整幅图像或者在Z平面进行图像堆栈与传统宽视场荧光成像同样耗费时间。当在不能用单条线扫描完全涵盖的多个神经结构功能性信号比较时，它存在很大的问题。不幸的是非同时性的多个线位置连续数据收集通常不是一个能说明问题的选择，因为在实验间变异性很大的神经元响应中它得出的结论太间接。(seee.g. Passaglia and Troy, 2004; Warzecha and Egelhaaf,1999).在获取整幅图像时提高时间分辨率的技术，例如转盘共聚焦显微镜，虽然有新的发展，在活样品的致密组织应用中获得的信号过于微弱。(see e.g.Coates et al., 2004; Nakano, 2002).
 

在这个研究中，我们调查了是否多线TPLSM能够帮助克服在功能性成像中时间分辨率和空间分辨率间的权衡。多线TPLSM的原理以基于镜面的光束分光器为基础，它可以把一束激光分解成多束(Nielsen et al.,2001).在TPLSM中，激发内在性限定在激光很小的焦点处，这个分光器可以在样品的焦平面上产生多个这种激发点。我们证明这种多焦点模式可以有效地用于同时执行多个线扫描。而且，使用多激光焦点扫描时图像的获取速度会提高，因为每条光线只扫描图像的一部分，或者每个样品点被多条光束成功激发。近来，一个相似的光束分光器设计已经被提议用到荧光寿命成像上。(Leveque-Fortet al., 2004).

 

对正常动物的成像是功能性成像最具挑战性的工作(for review see: Helmchen andWaters,2002).我们使用苍蝇视觉系统的神经元钙离子动态监测作为多线TPLSM的关键测试。Blowfly大脑中的视觉运动处理区域，小叶板，包含了60个大的可独立识别的方向选择性神经元，所谓的切向细胞TC。(forreviews see Borst and Haag, 2002; Egelhaaf and Borst, 1993; Egelhaaf etal., 1988, 2002, 2005).这些神经元已经成为研究近乎自然状况下神经信息处理的唯一模型系统。在电生理学与光学记录实验中，TC表现出作为运动感受器的功能，每一个神经元被以一种特殊的方式裁剪以适应来自移动中眼睛产生的动态模式的光流信息的精确明显的组分(D¨urret al., 2001; Egelhaaf et al., 1993; Krapp and Hengstenberg, 1996;Single and Borst, 1998).由于来自外周局部动作敏感神经元的神经信号的视网膜拓扑取样TC具有大的感受域。而且，TC间的相互作用大大增加了感受野的大小和动作特异性(Haagand Borst, 2001; Horstmann et al., 2000).
 

使用钙离子成像作为TC局部树突活化的标记(Borst and Egelhaaf, 1992; D¨urr and Egelhaaf,1999; Haag et al., 2004; Single and Borst, 1998).而且，有证据表明树突钙离子的增加卷入了活性依赖的动作灵敏度度的调控，如动作调整(Kurtz et al., 2000).突触钙离子浓度改变的成像已经被用于描绘感受刺激中的分级突触传递的特点。(Kurtz et al., 2001). 在所有这种组织中，更高空间和时间分辨率的钙离子成像将帮助我们得出更直接的结论，例如树突输入整合，突触传导中的钙离子动态调控和通过钙离子的动作调节的潜在时空控制。
 

除了它的优越性能和在致密组织的深层激发过程中降低的光损伤之外，由于使用近红外波段激发，也避免了光感受器的视觉激发，TPLSM成为原位成像中的一种方法选择，尤其适用于视觉系统。(seee.g. Denk and Detwiler, 1999; Euler et al., 2002).通常，共聚焦和传统成像通常伴随着不需要的视觉激发，因为荧光染料的单光子激发光谱与光感受器的感受范围存在很大的重叠。苍蝇的视觉系统首次被用来通过单线扫描和一个雪崩二极管监测钙离子信号来检验原位TPLSM成像(Kalbet al., 2004). 之后，Haag et al. (2004)分析了条纹模式的动作中TC中的局部树突钙离子震动，以得出TC的局部动作检测器输入的计算模式。在后者的研究中，获得了64×64像素的图像，但是钙离子成像的时间分辨率只有8Hz。相对的,Kalbet al.(2004) 获得了高达400Hz时间分辨率的单线扫描图像，空间分辨率限制在10um的一条线。当前的研究首次表明TPLSM中的多线原理可以被如何有效地应用以弥补神经活动功能成像中时间分辨率与空间分辨率之间的空白。
 

2. 方法与结果

为了从激光扫描显微镜的功能性成像中得出重要结论，一个高的时间分辨率是很重要的。在低光情况下，这通常通过进行单线扫描来获取。这被以一个垂直系统（VS）神经元的突触前分支的激光共聚焦(LeicaSP2)钙离子成像示例(see Fig. 1, Table 1).这类神经元对其感受野内的向下运动以其膜电势的逐级去极化的方式响应，这伴随着突触前分支精细末端的钙离子聚集(Kurtz et al.,2001).为达到一个高的时间分辨率(400 Hz)，执行了单线扫描。记录中显示，扫描线应该击中了不同直径的两个神经元。模式运动期间钙离子指示染料荧光相对基线荧光的增加表明了细胞溶质自由钙离子浓度的增加。精细神经突中钙离子信号变化更快，不论是刺激动作期间的上升和刺激动作中止后的下降。
 

Fig. 1. Top: schematic of the fly’s head (caudal view). Vertical System(VS) neurons form an ensemble of 10 cells, belonging to the visualmotion-sensitive tangential cells in the fly brain. To study calciumconcentration changes in these neurons the lobula plate region wasexposed, a single VS2-neuron was impaled with a sharp glass electrodefor intracellular recordings and the electrically charged,membrane-impermeant calcium dye Oregon-Green 488 BAPTA-1 was driven intothe cell by applying hyperpolarizing current (?1 to ?2 nA for 3–5 min).Bottom: single-line scans were performed at the presynaptic region ofthe VS2-neuron with a Leica SP2 confocal microscope equipped with along-distance water-immersion 40×/N.A. 0.8 objective (excitation 488 nm,emission 500–560 nm, scan frequency 400 Hz). The arrow below the imageof the presynaptic arborizations (left) indicates line position. Duringdownwards motion of a squarewave grating (spatial wavelength: 32?,temporal frequency: 4 Hz, Michelsen contrast: 99.3%) intracellular freecalcium rised, leading to an increase in dye fluorescence (middle). Thetime course of relative fluorescence changes (_F/F0) is shown averaged over regions containing signal from the upper,thinner neurite (right, black trace) and the lower, thicker neurite,respectively (grey trace). Both the rise of the calcium signal duringpattern motion and its decline afterwards appeared faster in the thinneurite. For a more detailed description of animal preparation,electrophysiological procedures and visual stimulation see Kurtz et al. (2001).
 

在高度分支化的结构，如树突和突触前分支中，对通过单线扫描到的个体神经元间的钙离子动态差异进行系统分析是困难的，因为是否是一个以上感兴趣的区域被扫描线击中是很难控制的。为在一定程度上解决这个问题，我们推出了一种方法，通过多束激光取代单激光束的TPLSM进行钙离子成像。
 

2.1. 多线TPLSM的原理

来自一个可调谐Ti：Sa激光器(see Table 1)的脉冲化的近红外激光被导向一个基于镜面的光束分光器(Nielsen et al.,2001). 光束分光器的原理是组合了一个位于中央的50%光束分光镜和位于两侧的高反射镜(see Fig. 2). 光束分光器将入射光分为两束，高反射镜将光束重复送回中央的光束分光镜。这个过程产生了高达64束的成一列的激光束阵列。
 

在我们早期实验中(see also Kalb et al.,2004)使用的光束分光器包含了一个单一光学元件组，每一个元件都被固定在无振动平台上，并可直接调整。在后期实验中（此处所列数据都基于此实验），为了方便，这个用户定制的分光器被用一个新近开发的市场上可以买到的分光器(TriM-Scope,LaVision BioTec, Bielefeld, Germany)所取代。后者配置中所包括的关键组件有衰减器，光束望远镜，色散补偿，光束分光器，和xy扫描振镜，都被装在一个盒子里。

通过扫描器后，激光阵列从背后端口进入倒置显微镜(Olympus IX70)。一直暴露大脑的苍蝇，其一个单独的TC被钙离子敏感染料填充以用于荧光成像，被固定在显微镜载物台上。一个提供视觉刺激的LED板被放在苍蝇视野之内。
 

2.2.多线TPLSM中通过成像检测释放光

在单光束TPLSM中，光电倍增管PMT或者雪崩二极管APD可以很方便地用于释放光检测，由于双光子激发的原理，激发只发生在激光焦点处。因此，用于屏蔽离焦光线的共焦小孔变得不必要，并且可以使用NDD检测。这意味着激发光不会被送回扫描镜，而是直接进入位于靠近物镜处的具有大的活性面积的PMT。但是，这种简单检测模式在多线PTLSM中却很难实现，因为必须要分离出每一个激光焦点发出的荧光。因此，我们首先设想了一种使用多APD的检测模式在非扫描模式（descannedmode）下操作。这种检测模式的灵敏性是阳性的，在仅用一个激光束和单个APD的预实验中(Kalb et al.,2004).但是我们抑制了安装额外多个APD用于多线检测的想法，因为检测器的调整非常关键。取而代之的是，受到芯片信号放大的超灵敏度CCD（所谓电子增强CCD）的启示，我们决定在non-descanned mode下使用成像设备。在这种模式下，使用同步CCD读出光束一次或多次扫过样品来获取整幅图像。这相对于使用PMT或APD的点扫描检测，它们在每个激光焦点位置取一个值，图像通过将这些值与激光的位置进行关联来重构。在散射性组织中，使用成像检测取代点扫描检测在一定程度上不可避免地降低了空间分辨率。如我们所示，多线TPLSM也可以进行点扫描检测，但只能以远低于成像检测的时间分辨率进行（见本段后面内容和section3对两中检测模式进行关键评估）。
 

Fig. 2. Schematic of multiline TPLSM. Top: principle of themirror-based beam multiplexer as first described by Nielsen et al.(2001). A linear array of in this case eight laser beams is generated byrepeated separation at a 50%-beamsplitter mirror (BS) and reflection athigh-reflectivity mirrors (HR). Bottom: schematic of the components inthe setup for multiline TPLSM. The laser beam of a tunable Ti:sapphirelaser passes a shutter, an attenuator, a beam telescope to adjust thesize of the beam, and a dispersion compensation consisting of a pair ofprisms. The latter prevents elongation of laser pulses by compensatingfor the group velocity dispersion introduced by the glass in the opticalpath of the laser beam. The laser beam then enters the beam multiplexerwhich divides the laser beam into 64 beams. In the commerciallyavailable version of the beam multiplexer (LaVision BioTec, Bielefeld)used now in our setup the maximal number of beams can be reduced bysoftware-controlled replacement of part of the beamsplitter mirror witha high-reflectivity mirror. However, in order to generate a beam arraywith widely separated laser foci (as used for the recording shown inFig. 3B), manual blocking of some of the beams had to be used. Scanmovements of the beam array are controlled by nonresonant xy-galvo-scan mirrors. Before entering the microscope (Olympus IX70), asecond beam telescope is passed. The microscope long-distancewater-immersion 40×/N.A. 0.8 objective was mounted on a z-piezo tocontrol the focal plane for the acquisition of image stacks. The fly isfixed with bees wax at a small glass plate and mounted on the microscopestage to control its xy-position. Moving patterns are presented in the visual field of the flyat high contrast and fast update rate with a custom-built LED board. Themicroscope was not equipped with conventional epifluorescenceillumination. However, delivery of excitation light (mercury lampband-pass filtered at 420–480 nm) to the sample via a lightguide (notshown in the diagram) turned out more practical than TPLSM to localizethe dye-filled neuron at the beginning of an experiment. In the firstcase, a 465 nm beamsplitter and a 515 nm long-pass emission filter wasused. In the case of TPLSM a 680 nm beamsplitter in combination with aTP-emission filter (short pass 700 nm) was used. An EMCCD camera (AndorIxon DV887BI) was installed for the detection of emission light.
 

由于技术限制，直到现在，TPLSM中的成像检测主要限制在要么提供高水平的发射光，要么不要求高的时间分辨率(see e.g.Bewersdorf et al., 1998).为了获取更高的可能灵敏度（进而到时间分辨率），即使在正常动物原位成像过程中的暗淡激发光情况下，我们使用了一个背景照明CCD，在500-650nm处量子效率>90%（例如，在一个包含了大多数钙离子染料的激发峰的范围内）和高达1000的可变电子倍增增益因子(AndoriXon DV887BI)(Coates et al., 2004).
 

2.3. 多线TPLSM中的获取模式

我们以两种获取模式操作多线TPLSM：第一种，整个研究使用所谓“帧扫描”模式，以64束激光在X、Y方向扫描样品。因此焦平面上激发了均一性照明，假定光束阵列的横向步长尺寸没有过于粗糙（通常使用≤400nm的步长尺寸）。在Fig. 3A，展示了以“帧扫描模式”以8.2Hz获取的一个图像系列，显示了来自一个VS神经元突触前区域在模式动作发生时神经元的优选方向。在伪色图中，红和黄色表示了钙离子指示染料相对荧光(_F/F0)的增加，与细胞溶质自由钙离子浓度的局部上升相关。
 

在“帧扫描模式”中，高达20Hz的获取速度是可行的，如果神经元有足够高的染料着色密度。但是，大幅增加获取速度，需要以同时记录线扫描取代整幅图像扫描。通过将激光束阵列的扫描动作限制在X方向上实现了这一点。Fig.3B展示了以“多线扫描模式”以89.3Hz获取的与A同一区域的数据。为避免激光束间交叉干扰，在展示的例子中我们只使用了8束相距较远的激光束（间距大约7um）取代了完整的64束阵列。当然也可以使用更多的激光束，那么独立光束间距会缩小（数据未展示）。在Fig. 3B展示的例子中，8线中的4线击中了焦平面上VS细胞的突触前区域。这种多线扫描的时间进程可估计等同于单线扫描的数据。



 

 2.4. 通过多线TPLSM进行的钙离子动态空间-时间分析                                                                                                                                                                                                    

通过多线TPLSM，相距太远或使用单线击中太难排列的多个神经元的同步钙离子信号，可以在精细时间尺度上进行比较。在Fig.3C显示的例子中，来自细侧枝之一的钙离子信号比来自主枝的细胞上升和下降都快得多。这一发现被来自低时间分辨率的“帧扫描模式”的图像序列中不同兴趣区域的钙离子信号比较所证实(seeFig. 3C, bottom).神经突间的表面积-体积比对这种钙离子动态差异的贡献已经被发现。(Kurtz, 2004).一个功能上的重要意义可能存在于这个事实中，突触前末端的快速钙离子动态有助于加速神经递质释放的控制(see e.g. Callaway etal., 1993; Macleod et al., 2002; Regehr and Atluri, 1995).

通过共聚焦和TPLSM，我们能够观察VS神经元轴突输出区域小的神经突出。这些结构让人联想起哺乳动物皮质神经元中的分枝状棘突，迄今为止还没有进行TC中的功能性成像。需要注意的是，大脑嗅球细胞棘突中的这些VS细胞棘突是否是纯粹的突触前或后，或二者兼有，目前仍未知。(Isaacsonand Strowbridge, 1998).  因为在棘突和上级树突中的钙离子调控在皮质棘突中起主要作用(for review seeSabatini et al., 2001), 我们比较了VS细胞棘突和邻近轴突干间的视觉刺激期间的钙离子动态(Fig. 3D).相对于从哺乳动物椎体神经元的研究中可以期望的结果，已经发现其棘突钙离子动态快于上级树突(Holthoff et al., 2002;Majewska et al., 2000)，棘突和上级树突或VS神经元独立的棘突间不存在钙离子信号的显著差异。(see Fig. 3D).
 

2.5. Sensitivity of the emission-light detection scheme——检测系统LaVision在不断改进，此文章资料较早，技术参数也较老，未译。