DEAE-Sephadex A-50提取法纯化多克隆抗体
互联网
1295
DEAE-Sephadex A-50 提取法纯化多克隆抗体
DEAE-Sephadex A-50(简称A-50)为弱碱性阴离子交换剂，经过NaOH处理将Cl- 型转为OH- 型后，可吸附酸性蛋白。γ1球蛋白属中性蛋白，等电点为pH6.85～7.5，其余均属酸性蛋白。在溶液为pH8.0时，酸性蛋白均被A-50 吸附。从而可分离纯化IgG。
1. 批量吸附法
此法可在1天内完成提取过程，纯化前后样品体积变化不大，所得IgG无变性现象，抗体效价亦无明显降低。制品可达PAGE及免疫电泳纯。适用于提纯人、羊、兔等血清中的IgG。
【材料和试剂】
（1）DEAE-Sephadex A-50。
（2）PB缓冲液：0.01mol/L，pH6.5 Na2 HPO4 -NaH2 PO4 缓冲液。
【操作步骤】
(1)A-50的预处理：称取4～6g A-50悬浮于500～1000ml蒸馏水中，1h后倾去上层细粒。然后将A-50浸泡于0.5mol/L NaOH液(60～100ml)中，搅拌后静置30min，以蒸馏水洗至中性，再用0.1mol/L NaH2 PO4 同上操作过程处理，蒸馏水洗至中性。最后用0.01mol/L，pH6.5 Na2 HPO4 -NaH2 PO4 缓冲液(PB)平衡，减压抽干，保存备用。
(2)吸附提取：取15ml血清加等量0.01mol/L，pH6.5 PB稀释至30ml(也可不稀释)，加入1/4体积滤干的DEAE-Sephadex A-50(相当于干重1g)混合。室温(或4℃)浸泡1 h后过滤，收集滤液。再加入同样体积的DEAE-Sephadex A-50重复上述处理过程共3次，亦可在血清内加入过量DEAE-Sephadex A-50吸附处理一次。收集滤液合并，即为提纯的IgG制品。或再透析去盐，浓缩、冻干保存备用。
2．A-50柱层析法
【材料和试剂】
（1）DEAE-Sephadex A-50。
（2）待纯化标本：杂交瘤腹水或培养上清，免疫血清或饱和硫酸铵粗提品。
（3）1.5×50cm 层析柱；透析袋及其他透析和层析所需的试剂和器材。
（4）PB缓冲液：0.1mol/L，pH7.4 Na2 HPO4 -NaH2 PO4 缓冲液。
【操作步骤】
（1）A-50经酸碱处理，平衡至中性后，浸泡于0.1mol/L，pH7.4 PB中，置4℃冰箱储存备用。
（2）装柱：同DE52。
（3）平衡：松开出水口螺旋夹，以PB平衡，控制流速为15滴/min，待洗脱液与流出液之pH值达到一致时，停止平衡。
（4）加样、洗脱、收集与浓缩：基本上同DE52，以0.1mol/L PB洗脱。
用过的DEAE-Sephadex A-50可用0.5mol/L Na2 HPO4 洗脱回收。洗至流出液中无蛋白(OD280nm<0.04)后再用蒸馏水洗至中性，加入0.02％叠氮钠于4℃保存备用。
