嵌合基因的构建（RT-PCR方法扩增VL、VH基因）
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嵌合基因的构建（RT-PCR方法扩增VL、VH基因）
【材料和试剂】
(1) 分泌McAb的杂交瘤细胞(如分泌抗转铁蛋白受体的杂交瘤细胞株)。
(2) 细胞培养常用试剂、培养液、器皿。
(3) 总RNA提取试剂 Trizol Reagenz。
(4) cDNA合成试剂盒。
(5) DNA提取试剂及分子生物学技术所需其他试剂和溶液。
(6) 核酸修饰酶类：T4 DNA连接酶、TaqDNA聚合酶、限制性内切酶等。
(7) 扩增小鼠IgVH和VL的引物
（8）表达载体：嵌合抗体的重组基因主要采用哺乳动物细胞表达载体，其功能元件含有原核基因序列，能在细菌中自我增殖，并带有只在真核细胞中表达的一个或多个真核转录单位。其中的原核序列包括能够在大肠杆菌中工作的复制子，便于筛选带重组质粒细胞的抗生素抗性基因，以及便于将真核序列插入质粒非必须区的少数单一限制性酶切位点。最基本的真核表达组件包含可转录外源DNA序列的启动子元件和转录产物有效地加上poly(A)所必需的信号。组件的另外一些附加元件包括增强子，以及带有剪接供体和剪接受体功能位点的内含子。
【操作步骤】
（1）设计数对简并PCR引物：VH和VL5’端引物与V区的前导序列互补，VH3’端引物与IgG(IgM)CH1 5’端及所有V区J段3’端互补，VL3’端引物与k（l）链CL5’端和V区的所有J段3’端互补，引物的简并性基本上不会造成PCR产物与原来基因序列上氨基酸的变异。下述引物可扩增出大多数单抗的基因。
1）小鼠VH5’端引物（引入SalⅠ酶切位点）
VH5’1-GGGGTCGAC CTCACCATGG[A/G]ATG[C/G]AGCTG[T/G]GT[C/A]AT[C/G]
VH5’2-GGGGTCGAC CTCACCATG[A/G]ACTTCGGG[T/C]TGAGCT[T/G]GGTTTT
VH5’3-GGGGTCGAC CTCACCATGGCTGTCTTGGGGCTGCTCTTCT
2) 小鼠VL5’端引物（引入SalⅠ酶切位点）
VL5’1-GGGGTCGAC CTCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT
VL5’2-GGGGTCGAC CTCACCATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAG
VL5’3-GGGGTCGAC CTCACCATGGAG[A/T]CACA[G/T][A/T]CTCAGGTCTTT
VL5’4-GGGGTCGAC CTCACCATG[G/T]CCCC[A/T][A/G]CTCAG[C/T]T[C/T]CT[T/G]
VL5’5-GGGGTCGAC CTCACCATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTG
3）小鼠VH3’端引物（引入NotⅠ酶切位点）
VH5’IgG-GGGGCGGCCGC GTTTTGGCTG[A/C][A/G]GAGAC[A/G/T]GTGA
VH3’IgM-GGGGCGGCCGC TGACTCTCTG[A/C][A/G]GAGAC[A/G/T]GTGA
4)小鼠VL3’端引物（引入NotⅠ酶切位点）
VL5’-GCGGCGGCCGC AGCCCGTTT[G/T]ATTTCCA[A/G]CTT
(2)从杂交瘤细胞提取RNA，反转录成cDNA,均按试剂盒说明书操作。
(3)进行RT-PCR，扩增VH、VL基因，并克隆，测序验证。
3. 嵌合基因的构建
目的基因和载体分别经相应酶切后，将VH基因插入带有人重链γ3恒定区基因的pSV2gpt质粒中构建成人-鼠嵌合重链基因。将VL基因插入带有人轻链κ恒定区基因的pSV2neo质粒中，构建成人-鼠嵌合轻链基因。然后将连接产物转染大肠杆菌，扩增培养，并制备大量质粒共真核细胞转染用。
