抗体的轻、重链嵌合基因共转染受体细胞
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抗体的轻、重链嵌合基因共转染受体细胞
目前将重组子导入宿主细胞主要采用的方法有磷酸钙沉淀法、DEAE-葡聚糖街道法介导法、聚季铵盐介导法、原生质体融合法、电转染法以及微注射法。其中以电转染效率较高。
【材料和试剂】
（1） 小鼠骨髓瘤细胞系Sp2/0细胞或P3X63.Ag8.653细胞，或CHO细胞。
（2） 已构建的轻、重链嵌合基因质粒DNA。
（3） 脂质体。
（4） 电转染仪。
（5） 无血清培养液、无血清的RPMI 1640、20％胎牛血清的培养液。
（6） 霉酚酸，G418，次黄嘌呤，黄嘌呤，胸苷。
（7） 羊抗人k链，人IgG标准品，酶标羊抗人IgG，酶标板等ELISA检测所用材料和试剂。
（8） 6孔细胞培养板，24孔培养板、48孔培养板以及96孔细胞培养板等细胞培养所用试剂和器皿。
（9） CO2 培养箱。
【操作步骤】
1．脂质体转染法
（1）于6孔板中接种培养SP2/O细胞，至铺满孔底，无血清的RPMI 1640洗三次细胞，并加入适量无血清培养液(约3ml)。
（2）各取20μg轻、重链嵌合基因质粒DNA，用无菌水稀释，与预先稀释的4μg脂质体混合，总体积为100μl，室温放置15min，共转染上述SP2/O细胞；边摇边加入DNA-脂质体混合物。
（3）于37℃，5％CO2 温箱培养10h以上，然后每孔加入3ml含20％胎牛血清的培养液；轻轻吹打细胞，分装一半到另一空白的孔内，培养24h后，换成选择培养液(含霉酚酸1μg/ml，G418 1μg/ml，次黄嘌呤6.8μg/ml，黄嘌呤2.0μg/ml，胸苷1.9μg/ml)，2周后，换成次黄嘌呤、黄嘌呤和胸苷的培养液，并逐步降低三者含量直到换成正常的培养液。
（4）一般于转染5d后便可观察到由少量细胞组成的集落，待细胞集落长满2/3孔底时，即可用ELISA检测上清液的抗体活性。
2．电转染法
（1）用一50ml离心管收集对数生长期的SP／20细胞，室温离心1000r/min´10min，弃上清。用30ml置冰预冷的PBS(pH7.3)重悬细胞，取1滴悬液显微镜下计数，取1´107 细胞。
（2）质粒DNA的酶切消化：为使质粒DNA线性化，以利于电转染，可使用PvuⅠ分别酶切消化VH、VL重组质粒。因为表达载体上只有PvuⅠ的单一酶切位电。
（3）电转染：取１ml冰预冷的PBS（pH7.3）+Hepes(100mmol/L)重悬细胞(1´107 细胞/ml)，取700ml，加入预冷的电转染样品杯中；用100ml冰预冷的PBS（pH7.3）+Hepes(100mmol/L) 重悬上述制备的PvuⅠ酶切消化的VH、VL重组质粒，将质粒DNA悬液加入样品杯中，混匀（以上操作均在冰上进行）。选用Bio-rad公司的Gene Pulser Transfection Apparatur 165-2078或Eppendorf公司的Multiporator电转染仪进行电穿孔转染。然后将样品杯取出，置冰浴10min。
（4）取一支无菌试管，加入12ml含20%FCS的1640培养液，并将电转染杯中的样品移入培养液中，混匀，接种24孔培养板（0.5ml/孔）,并以未转染的SP/20细胞作为对照，培养24h~48h后，换成选择培养液(含霉酚酸1μg/ml，G418 1μg/ml)。
（5）一般于转染5d后便可观察到由少量细胞组成的集落，待细胞集落长满2/3孔底时，即可用交叉ELISA双抗夹心法检测上清液的抗体活性。
3．克隆与检测
（1）交叉ELISA双抗夹心法：以羊抗人k链抗体包被酶标板，并用封闭液封板，加入待测上清，孵育后加入酶标羊抗人IgG，孵育后加底物显色，用酶标仪检测。
（2）采用间接免疫荧光法显微镜技术或FCM检测待测上清与转铁蛋白受体阳性细胞的结合率。
（3）用有限稀释法亚克隆阳性孔细胞。
（4）制备足够的抗体作进一步检测和鉴定。
（5）分别用抗人重链特异抗体、抗人轻链特异抗体、抗小鼠Fab抗体作ELISA和Western blot鉴定表达产物是否为人-鼠嵌合抗体。
（6）表达抗体的进一步纯化，抗体亲和力、特异性、活性等的测定。
【注意事项】
（1）由于目前抗体基因库的资料有限，上述较常用的引物可能不适于扩增一些特殊单抗的基因。此外，对某些杂交瘤细胞株亦可扩增出无抗体功能的VL基因，应重新设计引物。
（2）嵌合抗体保留了鼠源性单抗性单抗的可变区，体内应用时仍有较强的HAMA反应。第二代抗体的人源化是将鼠单抗可变区中FR换成人的FR，保留只与抗原结合的CDR部位，这是真正意义上的人源化抗体。
