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基因工程抗体抗体的纯化

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基因工程抗体抗体的纯化
对于表达的抗体需要纯化才能准确地进行活性、亲和力的鉴定及应用于临床研究。基因工程抗体的纯化方法与通常抗体纯化方法基本相同。本文主要介绍利用IMAC方法纯化。IMAC的方法原理是利用组氨酸的咪唑基能与二价金属离子,如Cu2+、Zn2+、Ni2+等发生螯合作用,在表达载体的抗体基因插入位点后面设计5~6个组氨酸,这并不影响抗体正确折叠成活性分子,经过一步洗脱,得到纯度较高的抗体。
【材料和试剂】
(1) Ni-NTA Resin(QIAGEN)。
(2) 大肠杆菌XL1-Blue。
(3) 载体pFUW80
(4) 超声缓冲液:50mmol/L磷酸钠缓冲液pH8.0,含300mmol/L NaCl。
(5) 洗脱缓冲液:50mmol/L磷酸钠缓冲液pH6.0,含300mmol/L NaCl。
【操作步骤】
纯化可溶性胞质表达抗体(ScFv)
(1)将pFS80转化大肠杆菌XL1-Blue感受态细胞,筛选阳性克隆,接种单菌落于40ml SB培养基(含Amp 100mg/ml;20mmol/L MgCl2 ),37℃培养至OD600 达到0.2,加1mmol/L IPTG,30℃诱导表达过夜。
(2)4000r/min离心10min,收集菌体,用超声缓冲液重悬菌体,每克菌体用2~5倍体积的超声缓冲液。20℃放置过夜,次日在冷水中融化;或者用溶菌酶1mg/ml,冰上放置30min。
(3)在冰上超声破碎菌体,直到核酸释放度达最大(A260)。若裂解物很粘稠,加RNA酶(10μg/ml)和DNA酶 1(5μg/ml)冰上旋转10~15min;或者,用注射器反复吹打数次。
(4)1000r/min离心20min,收集上清,加8ml预先用超声缓冲液平衡的50%SURRY的Ni-NTA Resin柱(直径1.6cm),每小时上样2~3个柱体积,操作在4℃下进行。
(5)用超声缓冲液洗涤平衡,0.5ml/min,直至A280小于0.01。
(6)用洗脱缓冲液洗柱,直至A280小于0.01。
(7)用洗脱缓冲液pH4.0进行梯度洗脱,紫外检测收集各洗脱峰,SDS-PAGE电泳鉴定。或用咪唑洗脱缓冲液(50mmol/L磷酸钠缓冲液含300mmol/L NaCl,0.5mol/L咪唑,pH6.0)进行0~0.5mol/L咪唑梯度洗脱。
纯化可溶性表达在周质腔的抗体
(1)诱导表达步骤同上。
(2)菌体用30mmol/L Tris-HCl含20%蔗糖,pH8.0的溶液重悬,每克细菌用80ml。在冰上滴加EDTA至浓度为1mmol/L,并温和摇动5~10min。
(3)4℃,8000r/min离心20min,弃去上清,用相同体积预冰冷的50mmol/L MgSO4 重悬细菌,冰上摇动10min。
(4)4℃,8000r/min离心20min,收集上清,即为冷的渗透压休克液。
(5)用超声缓冲液透析,去除EDTA。
(6)以下步骤同前(4)~(7)。
亦可根据各种蛋白的不同及纯化后的应用,可以添加各种试剂,如0.5~1.0%Tween-20;5~10mmol/L β-巯基乙醇;1mmol/L PMSF;增加NaCl浓度及加入10%甘油。
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