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单克隆抗体的纯化实验

最新修订时间:

原理

单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体,称为单克隆抗体。通常采用杂交瘤技术来制备,杂交瘤(hybridoma)抗体技术是在细胞融合技术的基础上,将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。

材料与仪器

蛋白质
Tris 腹水液 宁酸盐缓冲液 甘氨酸 乙酸盐缓冲液
超滤器 滤膜

步骤

1.  将蛋白A-Sepharose置于Tris缓冲液中(超过50倍的量,v/v)充分溶胀。在室温下将其灌入直径为2.5 cm 玻璃层析柱中,用Tris缓冲液使其平衡。

2.  腹水浓稀释于3倍体积的Tris缓冲液,以1~5 ml/min 的速度上样于蛋白A-Sepharose柱,用Tris缓冲液洗柱子直至所有的未结合的蛋白都被洗脱,采用A280监测。
 
3.  依次用2~3倍柱床体积的柠檬酸缓冲液、乙酸缓冲液液以及甘氨酸·Cl缓冲液连续洗脱结合蛋白,洗脱下的蛋白直接接入装有中和缓冲液的管中,中和缓冲液的体积应为所收集蛋白体积的1/4。

4.  采用ELISA法检测抗原特异性MAb。
 
5.  在超滤器中浓缩所分离的单克隆抗体到1~5  mg/ml,所用超滤膜为XM50,将单克隆抗体存于-20℃。

注意事项

样品进入柱床速度为1ml~2ml/min,以NaCl线形梯度洗脱。大部分单克隆IgG于40mMol/L和80mMol/LNaCl洗脱,也有极少例外的单克隆抗体于120mMol/L~150mMol/LNaCl洗脱。测OD280nm收集蛋白峰,单克隆IgG保存备用。

常见问题

单抗的特异性鉴定可以采用各种方法,如免疫荧光法、ELISA法、间接血凝和免疫印迹技术等,同时还需做免疫阻断试验等。


单抗的效价测定可采用凝集反应、ELISA或放射免疫测定。不同的测定方法效价不同。培养上清液的效价远不如腹水的效价。采用凝集反应,腹水效价可达5×104.而采用ELISA检查,腹水效价可达1.0×106.单抗的效价以培养上清和腹水的稀释度表示。


必要时还可以测定单抗的亲和力和识别抗原表位的能力测定。

来源:丁香实验

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