活化微珠交联的常见问题与解决方法
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活化微珠交联的常见问题与解决方法
虽然将抗体有效地与活性微珠交联是一项简单的工作，主要问题是要保持抗体的活性。抗体失活大多是由于抗体与微珠过度交联，或交联发生在抗体的抗原结合片段，使与微珠交联的抗体结合抗原的能力显著低于未交联的抗体。通常能够保持l0~50％抗体活性，这可认为是活性良好水平。在交联过程中，如果抗体的活性远远低于这一水平，可采取下列三种措施保持抗体活性。
（1） 在彻底交联之前终止反应，交联率可以在开始实验前测定。当不到50％的抗体发生交联时即停止反应，未交联的抗体不会受到影响，并可以用于其他实验，及早终止反应可以控制抗体多位点交联。终止交联反应的恰当时间可通过用少量样本的预实验来确定。未交联的抗体可通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，用考马斯亮兰染色来测定重链和轻链条带。
（2） 调整反应的pH值以减慢交联速度。大多数交联方法是通过抗体上的氨基连接，而氨基基团的反应对pH较敏感。如果抗体交联的pH值低于氨基基团的pK值，大多数氨基基团将不会发生交联，这样就控制了过度交联。采用中性的pH值，有助于这一问题的解决。如果仍然出现过度交联，可以试用略低pH值。选用合适的pH值需凭经验或通过多次试验才能确定，不同的抗体所需的条件也不一样。可以采用逐渐降低pH值（如0.5）的方式来测试新的交联条件。另一方面，如果交联率太低，可以增加缓冲液的pH值，或延长交联时间。pH值在8.2以上时，可用0.5mol/L碳酸盐缓冲液代替磷酸盐缓冲液。
（3） 将其他氨基基团引入抗体交联反应。在预试验时，用不同浓度并带有氨基基团的小分子物质阻断抗体结合到微珠上。两种最常用的化合物是乙醇胺和甘氨酸。从中选适当浓度的封闭剂使交联过程中只有约10％的抗体结合。选择合理的起始浓度，建议抗体的最终浓度不超过10mg／m1湿微珠。
最后，所用的抗体在其抗原结合片段内可能分布有氨基基团。这个基团与活性微珠结合后特别容易失活。在交联反应中，如果抗原结合能力不断丧失，可改用蛋白A或蛋白G微珠，并使用不依赖于氨基基团的双功能结合剂进行交联。
