标准PCR方法

标准PCR方法

 

典型的PCR扩增必须具备下述基本条件,以构成PCR反应体系：

10×Taq DNA聚合酶反应缓冲液：

     10～50 mmol/L Tris-HCl (pH7.5～9.0)

     6～50 mmol/L KCl或 (NH₄ )₂ SO₄

         1.5～5  mmol/L MgCl₂ 或 MgSO₄

0.2 mmol/L dATP, dCTP, dGTP,dTTP

0.1～1μmol/L 每种寡核苷酸引物

2.0～2.5U 耐热Taq DNA聚合酶

核酸模板，10² ～10⁵ 拷贝

加蒸馏水至100μl

 

【试剂与材料】

引物：扩增不同的目的DNA，引物亦不同；

Tag DNA聚合酶：Perkin-Elmer-Cetus公司、N.F.Biolab、Pharmacia公司、国内华美公司、复旦大学和中国医学科学远友谊公司等均有商品供应；

10×Taq DNA聚合酶反应缓冲液：成分同上；

5mmol/LdNTP储存液：将dATP、dCTP、dGTP和dTTP钠盐各100mg合并，加3ml灭菌去离子水溶解，用NaOH调pH至中性，分装保存于 -20 ℃。

标本处理试剂：不同标本处理方法不同，根据具体情况而定。

 

【操作方法】

（1）   向一微量离心管中依次加入：

ddH₂ O             补至终体积（50～100μl ）

10×PCR缓冲液     1/10体积

dNTP               各200μmol/L

引物               各1μmol/L

DNA模板            10² ～10⁵ 拷贝

混匀后，离心15s使反应成分集于管底。

（2）   加石蜡油50～100μl于反应液表面以防蒸发，每加一管换一次吸头；

（3）95℃～97℃变性5～10min，冷至延伸温度时，加入1～5U Taq DNA聚合酶；     

（4）将管放入PCR扩增仪中，按下列程序开始循环：

   变性   94～97℃     30～50s

   退火   25～65℃     60～90s

   延伸   70～74℃     60～120

   重复25～35个循环。

   时间延续   72℃，10min

               4℃，10min（可以放置过夜）

（5）反应结束后，短暂离心，吸取少量（5μl）分析，其它样品储存于4℃。

 

【注意事项】

（1）   各种成分的实际用量应根据实验者选用的该成分的终浓度及拥有的储备液浓度进行核算。

（2）   变性、退火及延伸的具体温度和时间应根据实验者所扩增的目的基因和引物而决定。

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