转录因子磷酸化化学计量的确定及磷蛋白形成动力学的测定
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转录因子磷酸化化学计量的确定及磷蛋白形成动力学的测定
蛋白质 可逆磷酸化的调节在信号转导过程中有重要作用，是细胞生命活动的调控中心。磷酸化反应是泛指把磷酸基团通过酶促反应转移到其他化合物的过程。蛋白质的磷酸化则是指由蛋白激酶(proteinkinase，PK)催化把ATP或GTP7位的磷酸基传移到底物蛋白质氨基酸残基上的过程，其逆转过程是由蛋白磷酸酶催化的，称为蛋白质的脱磷酸化。蛋白激酶催化蛋白质的含羟基氨基酸(丝氨酸／苏氨酸和酪氨酸)的侧链羟基形成磷酸酯。蛋白质磷酸酯酶(proteinphosphatase，PPase)催化磷酸蛋白的磷酸酯键水解而去磷酸化。细胞内任何一种蛋白质的磷酸化状态是由蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶的两种相反酶活性之间的平衡决定的。
(一)磷酸化作用化学计量确定的基本步骤
(1)在冰浴中建立下列反应混合液
Tris―HCI(50mmol／L；pH8．0)／MgCl2 (10mmo!／1) 250ul
ATP(10mmol／L) 1 ul
纯化的DNA结合蛋白(1mg／m1) 4 ul
[γ―32 P]ATP(481kBq) 1.3 ul
(2)将反应液混合物分成125ul两个部分，记为A部分和B部分。B部分将用于动力学实验。
(3)在6个干净管中各加入20ulA部分溶液，然后各管中依次加入0，0．5，l，2，3和4微单位的蛋白激酶以开始磷酸化测试。室温下反应30min。
(4)将10ul每一磷酸化测试混合液点在一张2crux2cm的Whatman 3MM滤纸上，将该滤纸在10％TCA+1％焦磷酸钠溶液中洗10rain(每张滤纸用5m1溶液)，更换溶液重复洗两次。用100％乙醇洗滤纸。通过对每张滤纸所发出放射性的计数来确定每个样品中磷蛋白的掺人量。
(5)在每个管中加人1．1ul100％TCA，以沉淀管中剩余的10ul磷酸化测试混合液。在冰浴中放置20rain，室温下用微型离心机在10 000r／mln离心10mln以收集蛋白质沉淀。先用90％后用100％丙酮洗沉淀。在空气中干燥沉淀5rain。
(6)将样品加到SDS―聚丙烯酰胺凝胶的加样孔中，在160V下1X电泳缓冲液(10X贮液配制)中电泳40mln。用Saran~膜包裹湿胶，对X线片曝光3h左右。
(7)以放射自显影胶片为模板，切下与DNA结合蛋白相对应的被标记的条带。用5倍体积30％过氧化氢在37~C处理凝胶条带6一12h，以溶解DNA结合蛋白。通过对每个样品的契仑科夫放射的计数来确定磷蛋白的掺人量。
(8)用以下两种方法测定待测液中的总掺人量：①将9ul分析缓冲液L50mmol／L Tris：―HCi(pH8．0)+10mmol／LMgCl25加到lulA部分溶液中，将混合液点在一张2cmX2gm的Whatman 3MM滤纸上(不要用TCA处理滤纸)。对滤纸所发出的放射性进行计数。②将1ulA部分溶液加到适当体积的30％过氧化氢溶液中，并对契仑科夫放射性进行计数。
(9)计算掺人到蛋白质中的磷酸摩尔数。在本实验中，每个分析包含800pmolATP和8pmol(0，3 ug)蛋白质(如果待测DNA结合蛋白是GBFl的话，其相对分子质量为37 000)。l％掺人蛋白质中的放射性相当于每摩尔蛋白质含有lmol磷酸。
(二)磷蛋白形成动力学测定的基本步骤
(1)向A部分中加入18微单位蛋白激酶并在室温下放置，分别在第o，5，l0，20，25和30min时各取20弘1试样。取出后立即终止磷酸化反应，取其中10ul点在一张2cm~2cm的Whatman 3MM滤纸上，并用TCA处理，剩余10ul用1.1ul00％TCA沉淀。
(2)来自B部分样品的处理方法与A部分相同。
(3)确定磷蛋白形成的速率。
(三)用放射性标记磷蛋白和非标记DNA结合迁移率变动测定的基本步骤
(1)将2ul近似饱和磷酸化的DNA结合蛋白加入到110ul未用poly(dI―dC)配制的迁移率变动缓冲液中。
(2)取20ul到一个干净管中作为对照(样品1)，在剩余92ul中加入poly(dI―dC)至终浓度0．07ug～1；取出4份各20／11的等分试样(样品2～5)。
(3)分别在样品2，3和4中加入O，2和long非标记的DNA探针，在样品5中加人0．1ug超声处理的鲑精DNA，并将样品1～5于室温放置30min。
(4)在每个样品中加入5ul非变性上样缓冲液，并将样品加到非变性聚丙烯酰胺凝胶的加样孔中，以低于100V的电压在1X电泳缓冲液中电泳3h。用Saran~膜包裹湿胶，对X线片过夜曝光。更好的方法是在Whatman 3MM滤纸上干燥凝胶，加Kodak增感屏对X线片曝光。
