脂肪细胞发育分化的转录调控研究
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脂肪细胞发育分化的转录调控研究
脂肪 细胞在分化过程中获得形态学表型(例如脂肪细胞内脂滴的聚集)的同时，在分子水平上也发生了各种基因的表达变化。根据对分化前、分化中和分化后的细胞抽提液的双向电泳分析结果，发现在开始分化的5h内，至少有100种以上的蛋白质表达情况发生了变化，其中就包含了重要的转录激活因子。在分化过程中有利于脂肪细胞分化或脂肪细胞所特有的蛋白质组分会随分化过程增加，抑制脂肪细胞分化或对脂肪细胞的生理功能不必要的基因表达受到抑制。无数基因的这种有严格时序的变化，大部分都发生在转录水平上。我们在研究前脂肪细胞向脂肪细胞分化的过程中发现：①CHOP―10表达下调及C／EBPp程序性磷酸化是C／EBPp延迟激活下游基因的分子基础；②导致肥胖的脂肪细胞数量增加和脂肪细胞体积增大之间存在偶联关系；③AP―2al和SPl是抑制C／EBPc~表达的转录因子，可作为研究防治肥胖药物的靶点。
1．CHOP―10表达下调及C／EBPp程序性磷酸化是C／EBPp延迟激活下游基因的分子基础
前脂肪细胞诱导分化4h左右，C／EBPp表达达到最高水平，但此时C／EBPp没有DNA结合活性，不具有转录激活功能。CHOP―10属于C／EBP家族转录因子。C／EBP家族转录因子含有保守的羧基端碱性亮氨酸拉链区域(basiczipperdomain，bZIP)和氨基端的激活区域。羧基端区域由参与DNA识别的碱性区域和邻近的介导单体间形成二聚体的亮氨酸拉链结构组成。单体蛋白之间通过亮氨酸拉链形成二聚体，对于序列特异的DNA结合是非常重要的。CHOP―10与C／EBP家族其他成员所不同的是，CHOP―10碱性DNA结合区域含有一个甘氨酸和两个脯氨酸，而其他C／EBP家族成员在此区域则是非常保守的脂肪族和碱性氨基酸残基。CHOP―10的蛋白质结构特点使CHOP―10缺少DNA结合能力，并成为C／EBP家族成员的抑制调节因子。当CHOP―10与C／EBP形成异二聚体时，CHOP―10―C／EBP异二聚体则不能与经典的C／EBP位点5，―(A／G)TTGCG(C／T)AA(C／T)―3’结合，从而抑制后者转录激活的功能。
2．C／EBPp初表达时处于相对低磷酸化状态，从低磷酸化到高磷酸化的过程和C／EBPp得到DNA结合活性相一致
我们发现，MAP激酶使C／EBPp的Thr―188发生磷酸化，在此基础上GSK―3p进一步将Ser―184和Thr―179磷酸化，从而C／EBPp获得DNA结合活性以及转录激活活性。GSK―3p对C／EBPp的Ser―184和Thr―179残基的磷酸化依赖于MAP激酶对Thr―188的磷酸化。
3．导致肥胖的脂肪细胞数量的增加和脂肪细胞体积的增大之间存在偶联关系
肥胖不仅是脂肪细胞体积上的增大，还由于在脂肪细胞发育过程中，一方面干细胞形成前脂肪细胞，另一方面前脂肪细胞分化的早期脂肪细胞重新进入细胞周期(mitoticclonal expansion)，经过2轮分裂，脂肪细胞在数量上会增加4倍。笔者发现卫星DNA上存在C／EBP结合位点，C／EBPp获得DNA结合活性后能够结合到卫星DNA上，C／EBPp在细胞周期各个阶段都和染色体DNA结合在一起。因此，C／EBPp在脂肪细胞分化过程中具有两方面功能：一是调节细胞分裂；二是激活C／EBPa，诱导脂肪细胞成熟分化。在诱导野生型胚胎干细胞时也证实了这一点，发现有部分细胞以克隆形式存在，并最终被诱导分化为脂肪细胞。进一步研究证明，克隆的形成都是经诱导剂刺激后经过有丝分裂克隆扩增形成。
用C／EBPp敲除的胚胎干细胞进行同样实验，发现既没有克隆形成，也没有细胞分化为成熟的脂肪细胞。如果在C／EBPp敲除的胚胎干细胞中以腺病毒高表达C／EBPp，则又可见到克隆形成，以及有丝分裂克隆扩增的发生。因此认为C／EBPp为有丝分裂克隆扩增所必需。在有丝分裂克隆扩增过程中，edk2蛋白表达非常特异。GO／G1期cdk2是没有表达的，在S期可被诱导表达，在G2／M期表达降低。通过一系列抑制剂(如PD98059，U0126，以及cdk2抑制剂Roscovitine)抑制有丝分裂克隆扩增后，也抑制了脂肪细胞分化，从而证明有丝分裂克隆扩增和脂肪细胞分化存在密切关系。
4，AP―2al和SPl是抑制C／EBPa表达的转录因子，可作为研究防治肥胖药物的靶点
我们在研究C／EBPa自身调控时，发现在前脂肪细胞中存在转录抑制因子C／EBP。非分化蛋白(C／EBPa undifferentiated protein，CUP)。CUP通过两个结合位点结合到C／EBPa启动子上，使C／EBPa处于抑制状态。在受到激素诱导剂诱导时，CUP表达下降，C／EBPa发生去抑制。经分离、纯化和鉴定，发现CUP实际上是转录因子AP―2αl。细胞学实验证明AP―2al具有强烈抑制C／EBPa转录表达的活性。构建表达AP―2α1的腺病毒，能完全抑制C／EBPa表达，抑制脂肪细胞分化。
在C／EBPα启动子上存在C／EBP结合位点，在其附近还有另一转录因子SPl的结合位点，在前脂肪细胞中，SPl蛋白结合于该位点，可阻止C／EBP家族对C／EBPα的激活。在诱导分化过程中，SPl首先发生去磷酸化调节，然后被降解，使C／EBP结合位点与被诱导分化早期的C／EBPβ结合，从而激活C／EBPa的表达。在脂肪细胞的分化过程中，基因表达的调控主要是由C／EBP家族和PPAR家族的转录调控因子协调作用的。而在这两个家族的成员中，C／EBPa和PPARγ是两个最重要的转录调控因子。
