蛋白质组学研究色谱分析技术
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1944
蛋白质组学研究色谱分析技术
由液相色谱 、气相色谱、超临界流体色谱和毛细管电泳等所组成的色谱技术是现代分离、分析的主要组成部分。近年来色谱分析技术也取得了新的进展，大量新的高选择性、高分辨率色谱技术在蛋白质组学研究中发挥着不可替代的作用。其中，毛细管电泳(capillary electrophoresis，CE)、多维液相色谱1iquid chromatography，LC)等因具有多种分离模式、分离度高、耗样量少、易于和电喷雾离子化质谱技术(ESI―MS)实现在线联用，已成为蛋白质组研究中大分子生物快速分离鉴定的有效工具。
毛细管电泳是目前对生物大分子分辨率最高的分离、分析技术。由于采用极细内径的弹性石英毛细管作为分离载体，进样量小，可操作性强，分离快速、高效，因而它在蛋白质分离、糖分析、DNA测序、单细胞分析中发挥着重要作用。其中阵列毛细管电泳、亲和毛细管电泳、芯片毛细管电泳以及和其他高灵敏检测技术的联用最为引人注目。阵列毛细管电泳平台可允许同时操作多根毛细管，大大提高了分离、分析的效率。亲和毛细管电泳是研究生物活性分子间相互作用的有效手段，这种方法样品消耗量小、速度快、柱效高，并且所用溶液体系非常接近生物体液组成，可以得到较为真实的生物分子相互作用信息，已被用于生物活性物质如蛋白质、核酸、糖类等与药物分子之间的相互作用的研究，是一种非常有潜力的药物先导化合物的高效筛选工具。
多维色谱技术广泛应用于对蛋白质组学中复杂样品的分析研究中。根据分离机制的不同，可以将多维分离模式大致分为多维高效液相色谱(HPLC)、多维CE以及多维高效液相／质相联用三大类。与传统二维凝胶电泳相比，多维液相色谱系统最突出的优点是：①快速、灵敏，便于自动化，能够满足蛋白质组学研究高通量的要求；②对蛋白质全组分进行分析时的歧视效应大大减小。多维液相色谱／质谱联用有望成为蛋白质组学分离技术的一个新的增长点。目前已经有了全自动特征肽鉴定蛋白质的方法，利用多维液相色谱技术对复杂体系中蛋白质鉴定所需的还原和烷基化反应、胰蛋白酶酶解、固载化金属亲和色谱、反相色谱以及电喷雾电离质谱(ESI／MS)分析等，全流程操作实现在线自动化。Washburn等将不同的色谱分离模式以串联方式合并于同一色谱柱中进行，即在同一色谱柱的前半部分装填强阳离子色谱填料，后半部分填充反相色谱填料，经酶解的多肽混合物进样到强阳离子交换柱，以台阶梯度增加盐浓度，依次将馏分直接洗脱进入反相色谱填料上，线性增加乙腈浓度，对反相色谱填料上有保留的组分进行洗脱分离，并由质谱鉴定，这种方法称为多维蛋白质鉴定技术(multidimensional protein identification technology，MudPIT)。一个分析周期可检测100多种蛋白质，适用于蛋白质组学研究中蛋白质的大规模分离鉴定。Koller等利用这种基于多维液相色谱技术的MudPIT方法进行了水稻蛋白质组研究，同时还与传统的二维凝胶电泳分离／质谱鉴定的方法进行了结果比较，发现传统方法识别了556个水稻蛋白质(1 509个肽段)，而MudPIT方法共检出和识别了2 363个水稻蛋白质(5189个肽段)。这是至今由多维液相色谱技术鉴定蛋白质数目最多的文献报道，充分体现了多维色谱在蛋白质组研究中的巨大潜力。
多维CE在蛋白质组研究中的应用正处于起步阶段。多维高效液相色谱／毛细管电泳(HPLC／CE)系统是由Jorgenson等提出的，设计了两种不同的接口阀(环)设计(valve／100pdesign)和横向流控界面(transverse flowgating interface)，实现了反相色谱和毛细管区带电泳二维分离模式以及排阻色谱／反相色谱／毛细管区带电泳三维分离模式，并将它们用于蛋白质降解产物的分析中。
