组织常用固定剂和固定方法

组织常用固定剂和固定方法

 

    1．甲醛  是常用的醛类固定剂，甲醛(formaldehyde)通过与蛋白多肽链氨基酸侧链的功能基团，如氨基、羟基、酰氨基等结合，使蛋白多肽分子间形成亚甲基桥(-CH₂ -)，蛋白质不再发生改变，保存原位。其特点是组织形态结构保存好，穿透性强，组织收缩少。但是，醛基与抗原蛋白 氨基交联形成羧甲基，使抗原决定簇的空间构象发生改变，分子间交联形成的网络结构可能部分和完全遮盖抗原决定簇，使之不能完全暴露，因此，在免疫组织化学染色时产生假阴性结果。如果固定后能够充分水洗，可减少分子间交联。在免疫组织化学染色之前切片通过抗原修复还可使抗原再现。为减少固定剂与抗原的交联，在使用醛类固定剂时，应缩短固定时间(8～24小时)，降低固定温度(4℃)。由于上述缺点可以通过一定处理加以纠正，因此甲醛是首选固定剂。

    (1)10％中性缓冲福尔马林：商品试剂常为37％一40％甲醛水溶液，常按1：9比例使用，但甲醛的实际浓度为4％[配法：甲醛原液10ml，0．1mol／L磷酸缓冲液(PB，pH7．4)90ml混匀。

    (2)4％多聚甲醛磷酸缓冲液(多聚甲醛40g，0．1mol／L PBS 500ml，两者混合加热至6℃，搅拌并滴加1N NaOH至清澈为止，冷却后加PB至总量1000m1)。

 

    2．丙酮  为无色极易挥发和易燃的液体，丙酮(acetone)渗透力很强，能使蛋白质沉淀凝固，但不影响蛋白质的功能基团而保存酶的活性，用于固定磷酸酶和氧化酶效果较好。缺点是固定快、渗透力强，易使组织细胞收缩，保持细胞结构欠佳。一般4℃下30～60分钟为宜。

 

    3．醇类  性能与丙酮基本相同，有固定和脱水的双重作用，穿透力快，组织块收缩明显，硬化力强。用冷液能较好地保存酶和抗原的免疫活性，但醇类对低分子蛋白质、多肽及细胞质内蛋白质保存效果较差。解决的办法是与其他试剂混合使用。

 

    4．混合固定剂

    (1)Bouin液：先将饱和苦味酸750ml过滤，加入40％甲醛250ml，混合后存于4℃冰箱备用，临用前加入冰醋酸50ml。组织通常在4℃下固定6～8小时。此固定剂对肾脏结构保存不利。

    (2)Zamboni液：称取多聚甲醛20g，加入饱和苦味酸150ml，加热至60~C左右，持续搅拌，使之完全溶解。过滤、冷却后加Karasson-Schwh磷酸缓冲液(NaH₂ PO₄ ・H₂ O3．31g，Na₂ HPO₄ ・7H₂ 0 33．77g，加双蒸水至1000m1)。该固定液可用于光镜、电镜免疫细胞化学观察。固定时间以6-18小时为宜。

    (3)AAF液：为较常用的固定液(95％一100％乙醇85ml，冰醋酸5ml，浓甲醛l0ml)。

    (4)Clarke改良固定剂(100％乙醇75ml，冰醋酸25m1)，常用于冰冻切片的后固定。

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