免疫组织化学技术疑难问题剖析

免疫组织化学技术疑难问题剖析

 

1．非特异性背景染色

非特异性背景染色的常见问题和解决办法

常见问题                                 解决办法

操作过程中漂洗不充分           每步步骤后冲洗3次，每次5分钟

加试剂后切片干燥               防止切片干燥

组织切片折叠                   勿取折叠处观察染色结果

组织中所含过氧化物酶未阻断     可再配制新鲜3％H20：封闭，孵育时间延长

组织中所含内源性生物素未封闭   使用阻断剂阻断内源性生物素

组织抗原 弥散                   组织及时固定，固定液要符合标准

切片黏附剂过厚                 重新配制黏附剂涂片

血清蛋白封闭不充分             延长血清蛋白封闭时间或再次用2％BSA封闭

 

2．染色过强。

染色过强的常见问题和解决办法

    常见问题                                    解决办法

一抗浓度过高或抗体孵育时间过长          降低一抗浓度或缩短一抗孵育时间

孵育温度过高，超过37℃                  一般室温20～28℃

生物素化二抗或SABC-POD孵育时间过长      缩短孵育时间

DAB显色时间过长或DAB浓度过高            显色时间不能超过5―10分钟，以显微镜下观察为准

 

 

3．染色弱。

染色弱的常见问题和怒决办法

 

    常见问题                                                  解决办法

抗体 浓度过低或孵育时间过短                         提高抗体浓度，孵育时间不能少于60分钟

试剂超过有效使用期                                 及时更换试剂

操作中。滴加试剂时缓冲液未沥干。致使试剂稀释       每步骤滴加试剂前吸干切片中多余的缓冲液

复染或衬染太深                                     复染时要淡染细胞核

室温太低，低于15℃                                 适当延长孵育时间

组织经固定和包埋等处理后组织抗原被破坏，           新鲜组织及时固定。防止自溶

残留抗原未被抗体检出

蛋白过度封闭                                       封闭时间不要超过10分钟

 

4．染色阴性。

染色阴性的常见问题和解决办法

    常见问题                                   解决办法

操作步骤错误                              重新实验，设立阳性对照

组织中无抗原                              设立阳性对照实验，以验证实验结果

一抗与二抗种属关系错误                    仔细检查一抗与二抗种属关系

试剂盒与显色系统不相匹配                  使用与试剂盒相匹配的显色系统

试剂盒中一种或多种试剂活性降低            不同批号试剂盒不能混用，不能使用过期试剂盒

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