荧光显微镜的基本操作及注意事项
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荧光显微镜的基本操作及注意事项
1．基本操作步骤
(1)安装紫外防护罩。
(2)打开高压汞灯的电源控制箱开关。
(3)插入挡光板，中断光路。
(4)预热5―10分钟。
(5)将载有样品的载玻片放到载物台上。
(6)选择接物镜(按照先低倍，后高倍顺序)。
(7)旋转分光镜组件转盘，选择所需要的分光镜组件：“O”为观察透射光时用；“WU”为观察蓝色荧光时用(如DAPl)；“WB”为观察绿色荧光时用(如FITC)；“WG"为观察红色荧光时用(如TRITC)。
(8)使用阻断滤片(目前多数阻断滤片内置于荧光显微镜)。
(9)通过粗、细螺旋调整焦距。
(10)打开与显微镜连接的计算机，点击数码成像系统软件，采集数码图像。
2．注意事项
(1)因观察荧光使用的光源为高压汞灯，其中发出的光含紫外光，对人眼有损害作用，故必须安装紫外防护罩。
(2)为延长汞灯寿命，打开汞灯后不可立即关闭，以免水银蒸发不完全而损坏电极，一般需要等15分钟后才能关闭。
(3)汞灯熄灭后待完全冷却才能重新启动，否则灯内汞蒸气尚未恢复到液态，内阻极小，再次施加电压，会引起短路，导致汞灯爆炸。这样不仅损坏电器，更重要的是汞蒸气溢出，将导致工作室污染。故关闭汞灯之后，不能马上再次打开，必须等待至少30分钟。
(4)高压汞灯工作时会散发大量的热量，因此，工作环境温度不宜太高，必须有良好的散热条件。
(5)汞灯的使用寿命约200―300小时，在电源控制箱上有时间累计计数器，使用者要记录累计小时数，达到300小时，需更换新灯泡，否则亮度不够，影响观察。
3．荧光显微镜标本
制作特点和观察要求
(1)载玻片：载玻片厚度应在0．8―1．2mm之间，玻片太厚吸收光多，激发光难以在标本上聚集。载玻片必须光洁，厚度均匀，无明显自发荧光。有时需用石英玻璃载玻片。
(2)盖玻片：盖玻片厚度应约0．17mm，光洁。为加强激发光，也可用干涉盖玻片，这种特制盖玻片的表面镀有若干层对不同波长的光起不同干涉作用的物质(如氟化镁)，它可以使荧光顺利通过而反射激发光，这种反射的激发光可激发标本中的荧光。
(3)标本：组织切片或其他标本不能太厚，一般以5～20pm为宜，切片太厚可使激发光大部分消耗在标本下部，而物镜直接观察的标本上部不能被激发。切片折叠或杂质过多均可影响荧光的观察。
(4)封片剂：封片剂必须无自发荧光、五色透明。加上抗淬灭剂后再用指甲油(实际操作中体会指甲油封片效果很好，可做到薄而均匀)将盖玻片四周封固，既保持盖玻片不滑动，又能防止抗淬灭剂蒸发。在没有抗淬灭剂的情况下，也可使用含30％甘油的PBS，还可用甘油与0．5mol／L碳酸盐缓冲液(pH 9．0～9．5)等量混合液作封片剂。
(5)镜头的清洁：在油镜使用完毕后，需用擦镜纸沾上无水乙醇或3：7的醇醚混合液轻轻擦拭。
(6)及时观察：标本染色后应及时观察，因时间过长荧光会逐渐减弱。若标本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延缓荧光减弱时间。
