核酸的定量测定:紫外吸收法

一、目的：
学习和掌握应用紫外分光光度法直接测定核酸含量的原理及技术。熟悉紫外分光光度计的基本原理与使用。  二、原理：
DNA和RNA都有吸收紫外光的性质，它们的吸收高峰在260nm波长处。吸收紫外光的性质是嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统所具有的，所以嘌呤和嘧啶以及一切含有它们的物质，不论是核苷、核苷酸或核酸都有吸收紫外光的特性，核酸和核苷酸的摩尔消光系数（或称吸收系数）用E（P）来表示，E（P）为每升溶液中含有一摩尔原子核酸磷的消光值（即光密度或称光吸收）。RNA的E（P）260 nm（pH7）为7700―7800。RNA的含磷量约为9.5%，因此每毫升溶液含1微克RNA的光密度值相当于0.022―0.024。小牛胸腺DNA钠盐的E（P）260 nm（pH7）为6600，含磷量为9.2%，因此每毫升溶液含1微克DNA钠盐的光密度值为0.020。
蛋白质由于含有芳香氨基酸，因此也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在280nm波长处，在260nm处的吸收值仅为核酸的十分之一或更低，故核酸样品中蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。RNA的260nm与280nm吸收的比值在2.0以上；DNA的260nm与280nm吸收的比值则在1.9左右。当样品中蛋白质含量较高时比值即下降。
三、器材与试剂：
1．器材：
①容量瓶（50毫升）。
②离心管。
③离心机。
④紫外分光光度计。
2．试剂：
①钼酸铵-过氯酸沉淀剂[0.25%钼酸铵-2.5%过氯酸溶液]：取3.6毫升70%过氯酸和0.25克钼酸铵溶于96.4毫升蒸馏水中。
②样品RNA或DNA干粉。
四、操作步骤：
将样品配制成每毫升含5―50微克核酸的溶液，于紫外分光光度计上测定260nm和280nm吸收值，计算核酸浓度和两者吸收比值。

式中：O．D260为260nm波长处光密度读数；L为比色杯的厚度；0.024为每毫升溶液内含1微克RNA的光密度；0.020为每毫升溶液内含1微克DNA钠盐时的光密度。
如果待测的核酸样品中含有酸溶性核苷酸或可透析的低聚多核苷酸，则在测定时需加钼酸铵-过氯酸沉淀剂，沉淀除去大分子核酸，测定上清液260nm处吸收值作为对照。具体操作如下：
取两支小离心管，甲管加入0.5毫升样品和0.5毫升蒸馏水；乙管加入0.5毫升样品和0.5毫升钼酸铵-过氯酸沉淀剂，摇匀，在冰浴中放置30分钟，以3000转/分离心10分钟，从甲、乙两管中分别吸取0.4毫升上清液到两个50毫升容量瓶内，定容到刻度。于紫外分光光度计上测定260nm处吸收值。
五、结果与讨论：