核酸的定量测定:衣酚（苔黑酚）法

一、目的：

了解并掌握地衣酚法测定RNA含量的基本原理和具体方法。

二、原理：

RNA含量测定，除可用紫外吸收法及定磷法外，常用地衣酚法测定。其反应原理是：当RNA与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖继而转变成糠醛，后者与3，5-二羟基甲苯(地衣酚orcinol)反应，在Fe3+或Cu2+催化下，生成鲜绿色复合物。反应产物在670nm处有最大吸收。RNA浓度在20―250μg・ml-1范围内，光吸收与RNA浓度成正比。地衣酚法特异性差，凡戊糖均有此反应，DNA和其他杂质也能与地衣酚反应产生类似颜色。因此，测定PNA时可先测得DNA含量再计算RNA含量。

三、器材与试剂：

1．器材：
①分析天平。

②沸水浴锅。

③试管。

④吸量管。

⑤分光光度计。

2．试剂
①RNA标准溶液(须经定磷确定其纯度)：取酵母RNA配成100微克/毫升的溶液。

②样品待测液：配成每毫升溶液含RNA干燥制品50―100微克。

③地衣酚试剂：先配0.1%三氯化铁的浓盐酸(分析纯)溶液，实验前用此溶液作为溶剂配成0.1%地衣酚溶液。

四、操作步骤：

1．标准曲线的制作
取12支干净烘干试管，按下表编号及加入试剂。平等作两份。加毕置沸水浴加热25min，取出冷却，以零号管作对照，于670nm波长处测定光吸收值。取两管平均值，以RNA浓度为横坐标，光吸收为纵坐标作图，绘制标准曲线。

2．样品的测定
取两支试管，各加入2.0ml样品液，再加2.0ml地衣酚-Cu2+试剂。如前述进行测定。

五、结果与讨论：

1．绘制出标准曲线

2．RNA含量的计算
根据测得的光吸收值，从标准曲线上查出相当该光吸收的RNA含量，按下式计算出制品中RNA的百分含量：

注意事项

(1)样品中蛋白质含量较高时，应先用5%三氯乙酸溶液沉淀蛋白质后再测定。

(2)本法特异性较差，凡属戊糖均有反应。微量DNA无影响，较多DNA存在时，亦有干扰作用。如在试剂中加入适量CuCl2・2H2O可减少DNA的干扰，甚至某些已糖在持续加热后生成的羟甲基糖醛也能与地衣酚反应，产生显色复合物。此外，利用RNA和DNA显色复合物的最大光吸收不同，且在不同时间显示最大色度加以区分。反应2min后，DNA在600nm呈现最大光吸收，而RNA则在反应15min后，在670nm下呈现最大光吸收。