平衡法选择高亲和力噬菌体抗体
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[器材和试剂]
● 链霉亲和素磁珠(DynabeadsM280,Dynal)
● 磁性1.5ml试管架(Dynal)
● 磷酸盐缓冲液(PBS)
● 2%脱脂奶粉PBS(2%MPBS)
● 生物素化试剂盒
● 含0.1为Tween-20的PBS(PBS/Tween)
● 100mmol/L HCI
● lmol/L Tris.pH 7.4
● 对数期生长的大肠杆菌TGI细胞
● 用于自文库甘油储存料中制备噬菌体抗体的设备和试剂
● 由定位突变或链改组制备的scFv突变衍生物文库
[方法]
1. 多样化的噬菌体抗体丈库中制备噬菌体抗体。
2. 根据厂家说明,对抗原进行生物素化。
3. 选择前,在1个1.5ml微量离心管中。用2%MPBS 1m1封闭150ul链霉亲和素磁珠,室温1小时。用磁性试管架将碰珠吸向一侧。弃去缓冲液。
4. 用2%MPBS封闭3个1.5ml微量离心管,室温1小时;而后,弃去封闭缓冲液。以3个不同浓度将士物素化抗原(总共3管)与溶于2%MPDS(终浓度)的1m1噬茼体样品(大约1012c{u/m1)进行孵育,室温振荡l小时。对于第一轮选择,抗原浓度应分别为Kd/l、Kd/10以及Kd/100;此处Kd=针对抗原的野生型抗体亲和力。
5. 每管加入50ul链霉亲和素化磁珠并在转台上孵育,室温15分钟。将试管放入磁架30秒。磁珠将移向磁体。
6. 抽吸上清,让磁珠留在微量离心管一侧。最好是用200u1吸头套在巴氏吸管上,再接 到真空源上进行。用PBS/Tween洗涤磁珠7次(每次洗涤用1ml),接着用MPBS洗涤2次,再用PBS洗涤1次。每隔一次洗涤就将磁珠转移到1个新的1.5ml试管中,以充分洗涤。
7. 用100ul 100mmol/L HCl将噬菌体从磁珠上洗脱下来,室温10分钟。将试管放入磁架30秒,沉淀磁珠。移取含有洗脱的噬茼体上清,并用1m11inol/L Trls(pH 7.4) 中和。冰上保存洗脱液。
8. 将0.75ml洗脱噬菌体加入到10ml对数生长的大肠杆菌TGl(A600约0.5) 中。4℃下储存剩余的洗脱噬菌体。
9. 37℃下静置孵育洗脱物-大肠杆菌混合液,30分钟。
10. 将1ul和10ul感染的TGl细胞在100mmTYE/amp/glu平板上铺板接种,滴定洗脱液(稀释比例分别为104和103)。
11. 离心剩余的细菌培养液,2700g 10分钟。将沉淀重悬于250ul 2×TY中,并在2个150mmTYE/amp/R1u平板上铺板,37℃孵育过夜。
12. 次晨,每个平板加入3m1 2×TY/amp/glu,再用弯曲玻璃棒自平板上刮取细菌。将1.4ml菌液与0.6m1 50%的甘油(无菌过滤)混合制备甘油储存料。-70℃下保存。分析产出滴定结果(步骤9)以确定哪个(从抗原农度=Kd/1、Kd/l0以及Kd/100)确定出相应的噬菌体以用于下一轮选择的改良。过去,我们依据噬菌体EUSA测定的结合性克隆阳性率或依据BIAcore测定的活性噬菌体浓度,进行判断。不过根据经验,可以通过分析产出滴度作出选择: 当产出滴度比抗原浓度下降更明显时(即当比较来自Kd/l、Kd/10以及Kd/100的3个产出滴度时),一般是结合减少的结果,那么此浓度下的噬茵体不应用于后续的选择。而应当用较高抗原浓度的噬菌体替代。我们每轮把抗原浓度平均降低大约90%倍,而在亲和力成熟的最后一轮常常使用飞摩尔级的抗原浓度。
13. 从来自步骤ll的合适的甘油储存料中制备噬菌体抗体;从本实验方案步骤1重复进行。