大片段DNA测序（>50KB）

鸟枪法测序的操作方法

1、用限制酶切下目的片段的大片段Insert DNA，并用Agarose凝胶电泳进行回收。

2、对回收的大片段DNA用物理方法（如超声波等）进行切断处理，然后用T4 DNA Polymerase对小片段DNA进行末端平滑化。

3、进行Agarose电泳，切胶回收1kbp ～2kbp的小片段DNA。然后用BcaBest DNA Polymerase在DNA的3'端加上一个A碱基。

4、把加上A-tail的DNA片段连入T-Vector中，然后转化，挑选克隆。

5、对阳性克隆（含1kbp～2kbp Insert）进行DNA测序。

6、对数据进行编辑，最后连成一条大片段的DNA序列。

DNA测序量

应该进行的DNA测序量以DNA片段实际长度的6-8倍量进行计算（针对实际片段大小确定测多少倍的覆盖率），对每个反应的有效测序长度定义为600Bases。

如：对100kbp的DNA片段进行测序时，可以按以下方法进行计算：

6倍测序量＝100,000 Bases×6/600 Bases＝1000个反应

8倍测序量＝100,000 Bases×8/600 Bases＝1333个反应

结果编辑

按上述所示的DNA测序量要求进行DNA测序，然后对其所有结果进行编辑。此时的测序结果会连接成数个DNA大片段（Contig）。

补缺工作

结果编辑工作结束后，会发现在数个DNA大片段（Contig）间的序列没有测定，此时应该通过primer walking来测序，进行整体DNA序列的补缺工作。