猪瘟单克隆抗体ELISA
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<font>一、材料及试剂</font>
1、猪瘟单抗纯化抗原
2、兔抗猪IgG酶标抗体
3、猪瘟阳性血清
4、猪瘟阴性血清
1~4均由指定的生物制品所购买。
5、ELISA反应板
6、包被液
碳酸钠 1.50g
碳酸氢钠 2.93g
H2O加至 1 000ml
pH值9.6
7、PBS液
氯化钠 8.90g
磷酸二氢钾 0.20g
无水磷酸氢二钠 2.13g
加双馏水 1 000ml
8、PBS-吐温洗涤液
PBS液 1 000ml
犊牛血清 5ml
混合即可
9、底物溶液
⑴ 0.1Mol/L柠檬酸液
柠檬酸 21g
双蒸馏水加至 1 000ml
⑵ 0.2Mol/L Na2HPO4液
Na2HPO4·12H2O 71.6g
双蒸馏水 加至 1 000ml
⑶ pH5.0磷酸盐-柠檬酸缓冲液
取⑴液 24.30ml
⑵液 25.70ml
混匀即可
⑷邻苯二胺液
取⑶液 50ml
双馏水 50ml
磷苯二胺 20mg
30%H2O2 0.15ml
待邻苯二胺溶化后再加H2O2,现用现配。
10、终止液
浓H2SO4(98%) 22.2ml
H2O 177.80ml
<font>二、操作方法</font>
1、用包被液将猪瘟弱毒单抗纯化酶联抗原、猪瘟强毒单抗纯化酶联抗原各做100倍稀释,每孔包被100µl,4℃湿盒过夜。
2、次日取出,甩去孔内液体,3×3′冲洗。
3、将待检血清以PBS液做400倍稀释,每孔加100µl同时将猪瘟阳性血清、猪瘟阴性血清各做100倍稀释,于对照孔中加100μl.37℃温育1.5h~2h。
4、重复第二步,取出,甩去孔内液体,3×3′洗涤。
5、将兔抗猪IgG酶标抗体以PBS液做100倍稀释,每孔加100μl,37℃温育1.5h~2h。
6、重复第4步。
7、每孔加底物溶液100µl,室温下观察显色反应。当阴性对照孔稍显色时,立即终止反应,并以阴性孔做空白对照。
8、每孔加终止液50µl立即于酶联免疫吸附检测仪测定490nm波长的光密度。
<font>三、结果判定</font>
在猪瘟弱毒酶联板上,OD≥0.2,为猪瘟弱毒抗体阳性;OD<0.2,为猪瘟弱毒抗体阴性。
在猪瘟强毒酶联板上,OD≥0.5,为猪瘟强毒抗体阳性;OD<0.2,为猪瘟强毒抗体阴性。