C3裂解产物C3d的定量检测

C3d的定量检测采用ELISA双抗体夹心法，其原理为抗C3d血清能与C3、C3b、C3bi发生交叉反应，根据C3SP与C3在不同浓度PEG中溶解度的不同，用11%PEG溶解待测样本中C3d，然后加至包被抗C3d反应板中，再依次加入HRP标记的抗C3d抗体和底物OPD/H202，用4mol/L H₂S0₄终止反应，于492nm读取吸光度，C3d含量与其吸光度呈正相关。

1、10mmol/LEDTA抗凝正常人或病人全血，2500rpm离心10min,取血浆置-70℃保存。

2、C3d标准品的制备 将菊糖按3mg/mL与正常人血清混合，37℃孵育1h，2000r/min离心30min，取上清作为C3d标准品。100ulC3d标准品加等体积22%（W/V）PEG60004℃孵育1h，混合物于4℃2000r/min离心30min，取上清用含0.01%BSA的PBS 1：1000稀释，然后对倍稀释到1：2000。

3、用1.0ug/mL、5.0ug/mL、10.0ug/mL三个浓度的兔抗人C3d抗体（Dakpatt产品）分别包被三个酶标板，每孔100t，4℃24h，次日取出，每孔加含1%BSA的PBS 100/uL，37℃21h，然后加上述稀释的上清100uL混匀，37℃反应1h，用0.5%酪蛋白缓冲液洗涤3次，加100uL1：1000稀释的辣根过氧化物酶标记的兔抗人C3d抗体，37℃ 45min，用0.5%酪蛋白缓冲液洗涤2次，最后用PBS洗1次，每孔加l00uL0.4mg/mL OPD底物溶液，然后加4mol/L H₂S0₄终止反应，于酶标仪上492nm读取OD值。

4、样本中C3d的检测 选择上述反应性好，结果清楚的酶标板的抗体浓度作为工作浓度，包被酶标板，4℃24h。取待检样本（血浆、尿液或脑脊液）100/uL加l00g/L 22%（W/V）PEG6000，4℃反应1h，然后4℃2000r/min离心30min，取上清。正常人血浆上清1：250稀释、尿液1：8稀释释、脑脊液1：32稀释，病人血浆上清1；1000稀释、尿液、脑脊液同正常人，稀释液为PBS。用含0.01%BSA的PBS从1：400-1：600对倍稀释C3d标准品，然后将各稀释度的C3d标准品和稀释的样本各100t分别加入包被有兔抗人C3d抗体的酶标板中，随后操作同步骤3。

5、结果计算 样本C3d的定量测定用AU/L（设想单位）表示，C3d标准品1：250稀释度被指定为1600AU/L，依次类推。标准曲线浓度范围为100-6.25AU/L，以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标绘制标准曲线图，根据标准曲线计算待测样本中C3d含量。

正常值：血浆为8.48±1.91AU/L（X±1SD），尿液为0.87±0.61mAU/L。