补体C4高压电泳及免疫固定技术
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1、原理 用神经氨酸酶和羧肽酶B处理EDTA抗凝血浆，神经氨酸酶的作用主要是去涎，羧肽酶B能切除分子p链C端的碱性氨基酸，去除副带，将经过两酶处理后的EIJE4抗凝血浆进行高压电泳，然后与抗C4血清作用形成沉淀带，将其漂洗后用考马斯亮蓝染色，参照第六届国际补体定型会议C4定型标准或C4标准血清，判断以的同种异型。
2、所需试剂
（1）羧肽酶B（carboxypeptidasetype I，Sigma）10mg/ml（170U/mg） 将羧肽酶B分装于若干支EP管中，每管15uL，-20℃保存，用时取出一管加lOOmmol/LNaCl至80g/L(可供17份样本用)；
（2）神经氨酸酶（neuraminidasetypeⅥ）IOU 将250rtl 0.2mol/L EDTA加入盛有神经氨酸酶的瓶中，-20℃保存。7.5ul EDTA抗凝血浆加2ul神经氨酸酶；
（3）抗C4血清 用时1:4或1:2稀释；
（4）透析缓冲液（pH6.8） NaH2P04 84.80g，Na2HP04 66.20g，Na4-EDTA 25.00g，加蒸馏水至2L，透析时用蒸馏水1:5稀释；
（5）EDTA缓冲液（pH7.2） Na2-EDTA（MW 336.20） 33.62g,Na4-EDTA（MW 380.20） 38.20g，加蒸馏水至1L；
（6）电极缓冲液（pH8.8） 三羟甲基氨基甲烷（Tris）90.40g、甘氨酸 112.40g、巴比妥 27.40g、NaOH 2.92g加蒸馏水至4L；
（7）脱色液 甲醇900ml、冰醋酸200ml、蒸馏水900ml；
（8）染色液 考马斯亮蓝3.02，加脱色液至1L；
（9）0.75％琼脂糖 称取0.75g琼脂糖（1CN或SEAKEM.M.E），加3mL0.2mol/L EDTA，38mL电极缓冲液，加蒸馏水至100ml，加热熔化。
3、操作步骤
（1）将透析液约几倒人一有盖方盘内，方盘上放一玻璃板，玻璃板上铺4层纱布，将透析膜贴在纱布上，不应有气泡。取7.5ul EDTA抗凝血浆与2ul神经氨酸酶、3ul羧肽酶B在透析膜上混合，然后利用虹吸法4℃透析过夜。
（2）将0.75%琼脂糖隔水煮沸或在微波炉中加热至琼脂糖溶液完全透明为止，立即倾注于125×260× 3mm玻璃板上，待其冷却。
（3）在凝胶板离阴极0.5cm处铺上2cm宽的4层滤纸，待滤纸完全浸湿后，轻轻揭掉；贴上塑料加样板，每孔加透析完毕的样本IOuL，留二孔分别加血红蛋白和C4分型标准品，静置30min，待样本完全浸入琼脂糖凝胶中，揭掉加样板。将加样完毕的凝胶板放在冷却循环电泳槽上，样本放在阴极，打开冷却循环泵（10℃），接通电源控制电流在65～80mA，电泳45rain或待血红蛋白迁移到离加样孔6～7cm处，停止电泳。
（4）将抗C4血清1:2或1:4稀释，均匀铺在电泳完毕的琼脂糖凝胶上，37℃30～45min，然后放人生理盐水中漂洗过夜，次日换一次生理盐水。漂洗后，用一层滤纸铺在凝胶板上，上面放2打皱纹纸用重物压住，待凝胶中水分吸干后放37℃烘干，然后放人0.3%考马斯亮蓝染色液中染色15rain，再放人脱色液中脱色，直至背景清晰为上。
（5）依照第六届国际补体定型会议分型标准或将待测样本与C4分型标准血清比较，判断待测样本的同种异型。
（6）C4缺乏（帜Q0）的判断：染色完毕的凝胶板，在激光扫描仪上进行条带密度扫描，以C4A及C4B条带密度扫描结果求取A/B比值，比值等于1g寸表示C4A、C4B可能不存在零基因，比值大于1时表示C4B可能存在一个零基因，比值小于1B寸表示C4A可能存在一个零基因。
