大鼠主动脉内皮细胞的培养

材料与方法：

材料 :

培养皿、培养瓶、烧瓶、试管，玻璃针等。

眼科剪、眼科镊、手术刀片。

5%CO2孵箱、PH计。

恒温水浴箱。

PMi1640培养基，D-Hank’s缓冲液 、胎牛血清，内皮生长因子（ECGF），青霉素，链霉素,戊巴比妥钠等。

方法：

1、取材：4～6ｗＷｉｓｔａｒ大鼠, 大剂量2%戊巴比妥钠麻醉处死，将处死后的大鼠浸入75%酒精中，放入超净台。在无菌状态下剪开胸腹腔，分离胸主动脉,用2ｍｌ注射器从主动脉弓处向胸主动脉注入D-Hank’s液,驱除残血,取主动脉弓至肾动脉一段，两端结扎剪断，放入60℃预热无菌水中2秒。然后置于准备好的RPMi1640培养基（含双抗）中。

2、剪切：在超净台上，将血管置于培养皿中,用眼科镊小心剥离外膜面的结缔组织,并从根部剪去所有肋间动脉。无血清培养基冲洗数遍,去除残血后,将动脉转移至另一含少量培基的无菌培养皿中，用刀片将主动脉两末端切去,剩下的主动脉切成宽1～1.5ｍｍ的环。

3、接种：将动脉环竖直放入35ｍｍ培养皿(1%明胶4℃预置过夜,用前2ｈ移入ＣＯ2培养箱,用前培养液冲洗)中。置ＣＯ2培养箱2ｈ后,加入1.5ｍl培养基。放入37℃,5%ＣＯ2培养箱中培养。72ｈ后细胞从环内外生长迁出,环内为内皮细胞,环外为成纤维细胞。将动脉环除去后,可看到内膜面细胞集落与外膜面之间有明显的无细胞区界限，用玻璃针剔除成纤维细胞,得到纯的内皮细胞生长克隆。继续培养10～15ｄ，此时FBS浓度为２０％,形成细胞单层。

4、置于5%CO2孵箱中培养，每隔3天换液，培养时添加15% FBS，5～10μg/ml的内皮细胞生长因子（ECGF）以及100μg/ml的肝素。待细胞90%~95%融合时，0.25胰蛋白酶消化传代。

5、内皮细胞鉴定：相差显微镜下,细胞呈单层铺路石状;免疫组化证明有vWF相关抗原存在。

6、注意事项:将分离出来的主动脉热处理时温度以60℃2秒为宜,太低则成纤维细胞多,太高或时间久则内皮细胞迁出减少。