核酸蛋白转移电泳及杂交

一、DNA Southern Blot及杂交

本技术可用于基因组DNA特定序列定位，尤其可分析某些基因的限制性内切酶长度多态性，对遗传性疾病的早期基因诊断、产前诊断或基因变异等方面的研究有应用价值，其过程包括：样品DNA内切酶水解、水解片断的琼脂糖凝胶电泳分离、分离后水解片断的转移(固定)、特异性DNA片断的分子杂交及放射自显影。

(一)样品DNA内切酶水解

限制性内切酶(RE)可裂解双链DNA，每种酶其特点是具有高度特异性的DNA裂解点和不同电离子强度的特殊反应条件。不同产品其反应条件不同，应根据说明书操作。单位(U)RE活性是在37℃ 1小时内能将1μg DNA所有特异性位点切断的酶用量。若用两种以上不同的内切酶，要注意RE的最适盐浓度，要由低向高逐级添加适量盐逐个进行DNA切割。

1、配液：10×限制性酶消化缓冲液

10×buffer O—无盐：100mmol/l Tris HCL pH7.4

1mg/ml BSA

100mmol/l MgCL₂

10mmol/l DTT(二硫苏糖醇)

10×bnffer l—低盐：缓冲液O

0.5mol/l Nacl

10×bnffer H—高盐：缓冲液O

1.0mol/l Nacl

2、操作步骤：

(1)将DNA(0.2～1.0μg)溶液加入EP管中,并加入适量H₂O总体积为18μl，混匀。

(2)加入2ml 10×限制酶缓冲液，根据厂家建议的盐浓度选择不同的缓冲液。

(3)加1～2U限制性内切酶充分混合。

(4)37℃温育适当时间，时间需先进行预试验，摸索所需消化的时间，通常用琼脂糖凝胶电泳鉴定，酶解充分，各片断分子量从大到小分布均匀。

(5)加入0.5mol/l EDTA pH8.0使达到终浓度为10mmol/l终止反应。

(6)消化后的DNA直接进行琼脂糖电泳，方法同前，可用于分析或Southern Blot。

(二)Southern Blot及杂交。

将经电泳走在琼脂糖中的DNA变性、中和后，以毛细管作用在高盐缓冲液中转移至硝酸纤维膜上，再用放射性探针检测与之杂交的DNA。

1、配液：

(1)变性溶液：1.5mol/l Nacl 0.5mol/l NaoH

(2)中和溶液：200ml 20×SSC

100ml 1mol/l HCL

100ml 1mol/l Tris HCl pH8.0加水至500ml。

(3)20×SSC： 在800mlH₂O中溶解175.3g Nacl和88.2g柠檬酸钠，加入数滴10mol/l NaoH调pH至7.0加水至1000ml，高压消毒灭菌。

(4)预杂交液：12.5ml 1mol K₃ PO₄ pH7.4

125ml 20×SSC

25ml 100×Denhardt’S溶液

5ml 5mg/ml鱼精DNA

250ml 100%去离子甲酰胺

82.5ml H₂O(总体积为500ml)

(5)100×Denhardt’S液：10g聚蔗糖(Ficoll400)

10g聚乙烯吡咯烷硐

10g牛血清白蛋白(组分V)

加H₂O至500ml

2、操作步骤(如图20-1)：

(1)内切酶消化的DNA，总体积为50μl，加入10μl加样缓冲液进行12-24琼脂糖电泳。

(2)用溴化乙锭染色，紫外灯下观察并照像，在胶的旁边放一尺子。

(3)将电泳胶取出，用以下各溶液浸泡处理，同时轻轻摇动：

500ml 0.2mol/l HCL 10分钟，水洗若干次

500ml变性液中浸泡15分钟×2

500ml中和溶液浸泡30分钟。

(4)剪一张硝酸纤维素膜，每边小于胶3mm。

(5)剪3～5层滤纸，大小每边比硝酸纤维膜小7mm，再剪一张滤纸，比胶的宽度长30～40cm，在一盘中加入数百毫升20×SSC，盘上搭一块玻璃，滤纸可从玻璃双侧浸到盘中的溶液。

(6)逐层放置滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜，其上再铺滤纸及吸水纸，并加以重物，胶和硝酸纤维膜之间不可有气泡，转移24～36小时

(7)取出该膜，用圆珠笔标记方向，放入2×SSC中5分钟，用滤纸吸干,80℃烘烤2小时。

(8)将该转移膜放在塑料袋中，加入6～10mL预杂交液，排出气泡，封口，42℃ 3小时或过夜。

(9)将标记的DNA探针煮沸5分钟，立即冷却，加入杂交液中，浓度为5×105 CPM/ML。

(10)倒去预杂交液，加入含探针的杂交液封口，42℃ 6h或过夜。

(11)取出转移膜，按以下条件洗膜

1×SSC，0.1%SDS室温2×15分钟

0.25SSC，0.1%SDS,42℃ 2×15分钟，气中干燥。

(12)将杂交后的膜曝光于X光片，暗盒中放射自显影2～7天，-70℃。

(13)X片显影、定影，然后读片

结果分析：此杂交技术可以对基因结构进行分析。杂交阴性带的大小，分布规律及根据带条信号强度测量其含量。

二、RNA Northern Blot及杂交

此法是将RNA分子在变性琼脂糖凝胶中可相互分离，随后将RNA转移至硝酸纤维素滤膜上，用放射性标记的探针进行DNA-RNA杂交，此法是研究RNA(特别是mRNA)的主要方法之一，可测量RNA的含量和大小。

1、配液：Northern 预杂交液：12.5m 1mol/l K₃PO₄ pH7.4

125ml 20×SSC

25ml 100×Danhardt’s液

5ml 5mg/ml 鱼精DNA

250ml 100%去离子甲酰胺

加H₂O 至500ml-20℃贮存

Northern 杂交液：500ml预杂交液加入标记探针及10%磷酸葡聚糖。

2、操作步骤：

(1)RNA变性电泳方法同前

(2)待溴酚兰走至胶的中部时，用水清洗胶数次，放置于500ml 10×SSC中浸泡45分钟，轻轻摇动。

(3)测量胶的大小，按下列顺序，从下向上为①横跨玻璃双侧的滤纸，双边可浸至20×SSC溶液；②胶；③硝酸纤维素滤膜；④亲和层吸纸；⑤吸水纸；⑥重物、转移4～6小时。

(4)取出滤膜80℃烘烤2小时。

(5)用6～10ml Northern预杂交液，42℃预杂交过夜。

(6)将已标记的探针煮沸，立即冷却，加入6～10ml Northern杂交液。

(7)去除预杂交液，加入含探针的杂交液，42℃，杂交过夜。

(8)按下列条件洗膜：1×SSC 0.1%SDS室温2×15分钟

0.25×SSC 0.1%SDS室温2×15分钟

(9)曝光于X光片暗盒中放射自显影1天。显影，定影，根据自显影条带的位置判定特定片断的位置和顺序，也可测含量。

三、蛋白Western Blot及分析

此项技术是一种蛋白质的固定和分析技术，是将已用聚丙烯酰胺凝胶或其它凝胶或电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维滤膜上，固定在滤膜上的蛋白质成分仍保留抗原活性及与其它大分子特异性结合的能力，所以能与特异性抗体或核酸结合，其程序Sonthern Blot相似，故称为Western Blot,第一抗体与膜上特异抗原结合后，再用标记的二抗(同位素或非同位素的酶)来检测，此方法可检测1ng抗原蛋白。

1、配液：

(1)转移电泳缓冲液：20mmol/L Tris HCL pH8.0

150mmol/l 甘氨酸

加14.5g Tris粉 67.08g甘氨酸于4l水中，加入1200ml

甲醇，加水至6l

(2)丽春红S溶液：0.5%丽春红S

1%乙酸

2、操作步骤（如图20-2）：

(1)用已制备好的SDS-PAGE分离的蛋白凝胶。

(2)用一张滤纸，剪成与胶同样大小，在转移电泳缓冲液中预湿，放在Scotch-Brit Pad上，在胶的阴性端放上滤纸，胶的表面用该缓冲液浸湿，排出所有气泡。

(3)在胶的阳极面放置同样大小浸湿的硝酸纤维素膜，排出气泡，再在滤膜的阳极端放置一张滤纸，排出气泡，再放一个Scotch-Brit Pad。

(4)将以上“三明治”样装置放入一个塑料支撑物中间，将支撑物放入电转移装置中，加入电转移缓冲液。

(5)接通电源：使胶上的蛋白转移到硝酸纤维素膜上，电压为14V 4℃转移4小时或过夜。

(6)将滤膜放入丽春红S溶液中5分钟，蛋白染色水中脱色2分钟，照像，用印度墨水将分子量标准染色，在水中完全脱色。

(7)将滤膜放在塑料袋中，每3张加入5mL封闭缓冲液(1克速溶去脂奶粉溶于100ml PBS中)，封闭特异性抗体结合位点，室温1h，摇动，倒出封闭缓冲液。

(8)在封闭缓冲液中稀释第一抗体，加入后室温放置1小时，将滤膜转到塑料盒中，用200ml PBS洗四次，摇动。

(9)在封闭缓冲液中稀释辣根过氧化物酶标记的二抗，重复步骤8。

(10)将滤膜放在100ml新配制的DAB底物溶液中，大约2～3分钟就可显色，用水冲洗终止反应、照像。

结果分析：分析阳性(显色)条带的分子量大小，而且根据信号(颜色)强弱分析蛋白表达量。