蛋白的生物活性测定方法

结晶紫法活性测定

1、取对数生长期的人胰腺癌SW1990细胞，用0.25%胰酶（以无钙镁离子PBS溶液配制，pH7.4）消化后，加入RPMI-1640培养基（10%新生牛血清，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素，pH7.2）吹打细胞，使形成细胞悬液。进行细胞计数，使细胞数为2~2.5×10⁵个/ml。接种于96孔细胞培养板，100µl/孔。接种细胞时须不断摇动细胞悬液，以保证各孔细胞数的均匀一致。96孔板放置于37℃、5%CO₂培养箱中培养22h，观察到孔中细胞长满70~80%。

2、在上述RPMI-1640完全培养基中加入放线菌素D，使终浓度为1.5µg/ml，配成样品稀释液。取此稀释液900µl至Eppendorf管中，另在9个5ml管中加入700µl稀释液。

3、用完全培养基将基因工程人肿瘤凋亡素样品（上海恰尔生物技术有限公司研制，批号：0304，冻干粉剂，蛋白浓度：2mg/支）复溶至1000µl（液体样品测定蛋白浓度后，直接进行下一步操作），取出100µl至已装有900µl稀释液的Eppendorf管中，充分混匀，尽量不起泡沫。再从此管中吸出100µl至下一管中，如此反复n次（即测定前10倍稀释若干次，直到与估计活性相接近时）。

4、从最后稀释的Eppendorf管中吸出700µl样品至已装有700µl稀释液的5ml管中，充分混匀。再从此管中吸出700µl至下一管同样装有700µl稀释液的5ml管中，如此反复9次（即测定时倍比稀释样品）。

5、弃去96孔板中旧的培养基，从第一个5ml管中吸取已稀释的样品100µl至第2排细胞孔中，每个稀释度作6复孔(n=6)；从第二个5ml管中吸取的样品加入第3排细胞中，依此类推，直至第10排孔结束。第1排中不含细胞，加入100µl/孔含有放线菌素D的稀释液作空白对照；第11排加100µl/孔稀释液作细胞对照；第12排加不含放线菌素D的RPMI-1640完全培养基。

6、将加好样品的96孔板置37℃、5%的CO₂培养箱中继续培养22h，显微镜下观察细胞形态变化，初步判断结果。

7、弃除培养板中的培养基，每孔加入100µl染色液（1.5mmol/L结晶紫）染色30min。洗去染色液，甩去水分并在吸水纸上拍打以使干燥。冲洗程度以在吸水纸上拍打时，没有颜色出现为宜。

8、充分干燥后，每孔加入100µl33%浓度的冰醋酸，在振荡仪上充分振荡使结晶溶解。设定λ=595nm酶联检测仪测定各孔的吸光值，据此数据进行统计学处理，计算出对细胞50%杀伤时所需的基因工程人肿瘤凋亡素的浓度。

[活性计算]

活性单位定义：在上述测定条件下，以50%SW1990肿瘤细胞被杀伤时，为基因工程人肿瘤凋亡素的1个活性单位。

1、样品的稀释度取常用对数。

2、根据对应的细胞毒活性（光密度值）与稀释度的对数，进行线性回归，得到计算公式y=ax+b，分析相关系数R值，符合统计学要求者进行下一步分析。

3、代入50%杀伤时的光密度值（即第11排细胞光密度值的一半），计算出稀释倍数的对数，再求出稀释倍数。

4、根据原样品浓度及稀释倍数计算出基因工程人肿瘤凋亡素对细胞50%杀伤时的浓度，再算出比活性。

5、其他细胞的检测方法同上，计算时根据对SW1990标定的基因工程人肿瘤凋亡素活性单位，先求出对细胞50%杀伤时的所需活性单位，再根据基因工程人肿瘤凋亡素对SW1990细胞杀伤的比活性算出相应的绝对量。

[计算结果]

0304批原液：比活为：1.03×10⁷活性单位/mg

蛋白的生物活性及结构测定方法

生物活性测定[37,38]是将人胰腺癌1990细胞以2×10⁵个/ml种入96孔细胞培养板，37℃5%CO₂培养箱培养4-6小时，用完全培养液（加有1.2µg/m的放线菌素D）做梯度稀释的样品加入细胞板（n=3）。置37℃5%CO₂培养箱，18h后弃上清，以结晶紫固定液（结晶紫0.5%，甲醛8%，NaCl0.1%，乙醇20%）染色15min，蒸馏水洗去结晶紫。每孔再加入200μ33%的乙酸，旋涡混匀，置酶联仪读出D（595）值，以未加细胞的空白孔为D本底。根据活性单位定义：使培养孔中的细胞50%死亡为一个单位。

MTT法――活性测定

1、接种细胞：用0.25%胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液配成单个细胞悬液，以每孔103-104个细胞接种于96孔板中，每孔体积200μl。

2、培养细胞：将培养板移入CO₂培养箱中，在37℃、5%CO₂及饱和湿度条件下，培养3-5天。（培养时间取决于实验目的和要求）

3、呈色：培养第3-5天后，每孔加入MTT溶液（5mg/ml）20μl，37℃，继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养液上清。每孔加入150μlDMSO（二甲基亚砜），振荡10min，使结晶物充分溶解。

4、比色：选择490nm波长，在酶标仪上测定个孔吸收值，记录结果。