RAPD技术及其在假丝酵母菌研究中的应用

    随着医学科学的发展及人们对深部真菌感染的重视，越来越多的新技术用于临床真菌的检测和鉴定，随机扩增DNA 多态性（RAPD）是在PCR基础上发展起来的一种新的基因分型方法。本文综述了假丝酵母菌RAPD分析技术应用的研究进展及前景。

    近年来，随着肿瘤、自身免疫病、器官移植、糖尿病、获得性免疫缺陷综合征（AIDS）等患者的不断增多，侵入性诊断治疗手段的广泛实施，各类免疫抑制剂和广谱、超广谱抗生素的大量使用，临床上真菌感染呈明显上升趋势^［1］，其中假丝酵母菌在医院真菌感染中最常见，占80%以上^［2］，故快速、准确地对其鉴定、分型并分析该菌种间、种内的亲缘关系对研究假丝酵母菌的致病性、药物敏感性、预防监测流行病学调查具有重要意义。传统的真菌分型方法主要是表型分型如形态学法、血清学法、药物敏感性分型等，但耗时费力，易受环境及人为因素的影响，鉴别力弱，稳定性差。随着分子生物学的发展，DNA 分析技术广泛应用于病原微生物的检测，如：限制性片段长度多态性分析（RFLP），单链构象多态性分析（SSCP），随机扩增DNA 多态性（RAPD），脉冲场凝胶电泳等，其中RAPD技术具有简便快速，短期内可以分析大量样本等特点，在医学真菌研究中显示出巨大的潜力。

    1 RAPD的基本原理

    随机扩增多态性 DNA 分型法（random amplied polymorphic DNA ,RAPD）又称任意酶链反应(Arbitrily primer PCR,AP-PCR)，由Williams等^［3］于1990 年创用，该方法利用任意10个左右的寡聚核苷酸链作引物，以所研究的基因组DNA 为模板进行PCR扩增，扩增产物（即DNA 片段）通过琼脂糖凝胶电泳，经溴化乙腚（EB）染色检测多态性，在扩增条件相同的情况下，不同种属的个体成相差明显，扩增产物呈现不同电泳带型，同种内不同个体由于基因突变、插入、缺失或置换影响引物的特定结合位点，导致DNA 扩增条带增多、减少或长度改变，而同一引物的扩增产物中电泳迁移率一致的被认为具有同源性，因此不仅反映生物个体之间的遗传稳定性，也能同时清晰敏感地反映出遗传差异。

    2 RAPD技术的主要优势

    RAPD方法建立在PCR基础之上，因此具有模板用量少、技术简单、灵敏度高和特异性强等优点，但与其他DNA 多态分析方法相比较，还有其独特的优势。

    第一，RAPD勿需知道模板DNA 任何序列信息，对其进行扩增，构建不同种、不同菌株的基因指纹图谱，进而分析DNA 的多态性，这是其他方法进行此类研究所不能比拟的。

    第二，鉴别力强。Bostock^［5］等将RAPD与PFGE、REA-RFLPs进行比较分析发现15株白假丝酵母菌中，PFGE产生14个电泳核型， E.CORI-RFLPs产生7种不同的DNA 型别,而RAPD则能分出13个亚型，是一种快速简捷的方法并有着与PFGE类似的分辨力。随后许多学者进行了类似的研究^［6-8］，对RAPD予以高度评价，认为目前已有的分型方法中，RAPD可能是第一位选择。

    第三，RAPD技术无需DNA 探针，不涉及Southern杂交，放射自显影或其他技术，操作步骤少，实验周期短，成本较低，能在较短的时间内筛选大量样品。

    3 RAPD技术在假丝酵母菌研究中的应用

    3.1 用于种间及种内菌株分型假丝酵母菌是条件致病菌感染中最常见菌群，其种间及种内分型具有重要的流行病学及临床意义。Robert^［9］等应用1个10bp 随机引物RAPD方法将分离自非相关患者不同解剖部位的32株白假丝酵母菌分成22个不同的DNA 型别。项明洁等^［10］采用优化实验条件对自上海瑞金医院临床分离的22株酵母菌菌株进行RAPD分析，从而得到假丝酵母菌具有不同的扩增指纹，进而揭示了RAPD在酵母菌分型中的应用。廉翠红等^［11］利用两条随机引物RAPD方法，将来源于不同阴道念珠菌病患者的97株临床分离株分别分成19个和21 个型别。可见，RAPD具有很好的分型能力。

    3.2 分析种间和种内菌株间的亲缘关系李冬梅等^［12］对48株致病性酵母菌的多态性及亲缘关系研究后发现，RAPD带型可清楚显示假丝酵母菌种间及种内的差异，亲缘关系研究也表明除季也蒙假丝酵母菌外，其他常见几种致感染的假丝酵母菌种间系数为82%~87%，同种不同菌株间的相似系数＞90%^［12］。张晓梅等^［13］对兰州医学院第二附属医院的阴道念珠菌病患者阴道的45株临床分离株进行RAPD分析，并将扩增带型进行聚类分析，将30株白假丝酵母菌分成7群19个亚群，15株非白假丝酵母菌鉴定到种的水平。白假丝酵母菌种内不同菌株间的相似系数在90%以上，不同种假丝酵母菌株间的相似系数介于80% ~90%。可见，RAPD可以较好地显示种间差异及种内多态性。

    3.3 研究种内不同基因型菌株与某些疾病临床表现的关系沈雪敏等^［14］用RAPD 分型法观察上海地区LP（口腔扁平苔癣）患者、OC（口腔念珠菌）患者和健康人的白假丝酵母菌分离株的基因同源性，以及同组各菌株间的基因同源性，发现 LP组与OC组白假丝酵母菌电泳RAPD带型相似性不高，说明在这两种口腔粘膜病中分离到的白假丝酵母菌致病性不同，提示不同基因型白假丝酵母菌的定植可能与口腔粘膜病的种类有关。曾晰等^［15］对四川地区的健康人和OLP（口腔扁平苔癣）患者的口腔白假丝酵母菌分离株的RAPD 基因分型结果表明，健康组、糜烂型OLP患者和非糜烂型OLP患者的白假丝酵母菌分离株的基因型构成不同，提示具有特定基因型的白假丝酵母菌与OLP的发生、发展可能相关，RAPD技术
可在基因分型水平上为探讨假丝酵母菌的致病性提供依据。

    3.4 追踪感染来源，确定感染方式 Hanaula等^［16］对40名2个月到24个月的儿童进行40个月的随访取样，用RAPD检查发现，有3对母子之间白假丝酵母菌有垂直传播的可能。 Ahmad等^［17］通过RAPD的方法证实1例血液系统近平滑假丝酵母菌感染的患者，其感染菌株与两位护士手上携带的为同一株近平滑假丝酵母菌，因此推测假丝酵母菌感染也有外源性的，特别是近平滑假丝酵母菌感染。Robert等^［8］采用RAPD法对一个烧伤单元在9个月期间分离自18例患者的84株白假丝酵母菌进行了流行病学调查分析，结果鉴定出7个DNA 型别并揭示了白假丝酵母在病房之间和患者之间的相互传播。

    综上所述，在多种基于PCR的分子指纹研究方法中，RAPD技术在显示DNA 多态性方面具有明显的优势，已被成功应用于假丝酵母菌鉴定、分型及遗传特征研究，但RAPD对实验条件敏感产生带型过多，为了减少鉴别上的人为误差，将 RAPD结果扫描并用计算机软件进行分析，提供了一种省时省力的评估方法，同时还能形成数据库以贮存备用。相信随着科研人员对RAPD技术的不断深入和了解，试验条件的逐步规范化，RAPD势必成为医学致病真菌检测和鉴定的重要手段，并为真菌感染的临床诊断、预防和治疗提供更有价值的信息。

参考文献
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作者单位：齐齐哈尔卫生学校基础教研室,哈尔滨医科大学在读硕士研究生（李菁）
哈尔滨医科大学微生物学教研室（马佳毓） 邮编 161000