RAPD技术在昆虫学中的应用

随机扩增多态DNA (Random Amplified Polymorphic DNA ，简称RAPD)是J.Williams和J.Welsh两个研究小组于1990年同时提出的一种随机引物扩增，寻找多态DNA 片段的遗传标记技术，它是建立在PCR技术基础上，以随机的寡聚脱氧核苷酸作为PCR反应引物，对基因DNA 进行扩增而显示DNA 图谱和对物种进行亲缘关系、系统发育分子水平的鉴别，以及分子生物学、分子生态学的研究。

RAPD标记的一个明显的特点是RAPD引物无特异性，可以用未知序列的基因组DNA 作为模板，通过PCR扩增获得一组不连续的DNA 片段，且RAPD所需引物较短，10个左右的寡核苷酸即可。其次，一套引物可用于不同生物，建立一套标准引物，便可用于生物种内多态性鉴定。由于DNA 扩增仪的使用，使操作自动化程度高，分析量大，免去了RFLP中制备探针、同位素标记、Southern印迹法及分子杂交等步骤，从而构成了RAPD分析速度快，所需DNA 样品少等优点：尤其使PAPD标记可以在对生物种没有任何分子生物学研究基础的情况下，对物种进行DNA 指纹图谱的构建。

一、RAPD技术在昆虫分类学中的应用

传统的昆虫分类方法都是以外部形态为依据，在大的分类单位内能清楚地确定一个物种的分类地位，但对于某些物种，在确定了它的属、族或种等分类地位时，仅凭借外部形态往往是难以确定的。由于物种的进化本质上是的进化，因而分子分类学可以在DNA 水平更精确地甚至定量地分析物种的进化速度、遗传距离以及由此推断系统关系。近年来，DNA 分类法有了很大的发展，越来越受到人们的重视，已成为古典形态分类方法的重要补充。因此选择合适的引物，通过RAPD技术就可以较容易地把基因内部的差异显示出来，从而为准确确定物种的分类地位提供依据。Black等(1992)首先将RAPD技术用于4种蚜虫的鉴别比较，他们采用4种10个碱基的随机引物对4种蚜虫进行RAPD反应，检测其扩增产物的多态性，结果表明，根据电泳谱带可以区分4个种。

同时，检测种内不同生物型以及同一生物型内不同个体扩增产物的多态性，种群内不同个体之间扩增产物的多态性。Puterka等(1993)用RAPD技术对多个国家采集的俄罗斯麦蛾Diuraphic noxia Mordvilko进行了系统分析，7种引物就产生了69条多态性条带，用这一方法可以鉴别所有供试种群；同时聚类分析表明从南非、墨西哥、法国、土耳其收集的种群与美国种群相似性很大，亲缘关系很近，而中东和俄罗斯南部种群间变异大，亲缘关系较远。杨效文等(1999)用RAPD技术研究了桃树、油菜和烟草上烟蚜的DNA 多态性其结果表明，在烟蚜的体色方面，与黄绿色相比，红色与褐色更为接近。韩雅莉(2001)运用随机扩增多态DNA 技术对斑翅蝗科中3属6种蝗虫DNA 进行了多态性比较，并根据各种间片段共享度构建了UPG聚类关系图。研究结果表明，大垫尖翅蝗和甘蒙尖翅蝗的片段共享度为0.375。红翅皱膝蝗和鼓翅皱膝蝗的片段共享度为0.268，亚洲小车蝗和黄胫小车蝗的片段共享度也为0.286。

二、RAPD技术在昆虫分子生态学研究中的应用

昆虫分子生态学是从基因水平上来研究生物之间以及生物与环境之间的关系。目前， RAPD技术在该领域主要用于种群的遗传变异程度和种群间遗传分化程度、天敌昆虫的标 识和鉴定、害虫生物型鉴别、个体遗传标记以鉴定亲缘关系以及昆虫生殖策略的研究。 Roehrdanz等(1993)用RAPD技术标识了不同地理起源的北美瓢虫一蚜虫天敌，为正确地 引进天敌、控制蚜虫的为害起了决定性的作用，同时指出RAPD技术可用于区分关系近缘的天敌昆虫，在利用天敌控制害虫方面有着巨大的经济意义。陈乃中等(1997)用RAPD技术鉴定了4种仓库幼虫，电泳结果显示，用5种引物均产生了可以用于区分这4种昆虫的扩增谱带，表明RAPD技术在昆虫尤其是幼虫的快速鉴定中有应用前景。

Gawel等(1993)从椰粉虱(Aleyrodinae)的卵和若虫中提取DNA 进行RAPD扩增，所用20种引物都能准确地把椰粉虱的两种生物型(A型和B型)区分开。Ban-o等(1997)报道，用RAPD技术可以把甘薯粉虱Bemisia inconspicua(Quaintance)的生物型B与其他生物型区分开，表明RAPD技术可用于区分亲缘关系密切的生物类群。Wilkerson(1993)用RAPD标记研究了非洲疟蚊的两个实验种群，使用57种引物，扩增出了377条DNA 带。两个种群间有295条带不同；选取其中产生条带清晰、重复性好的13种引物进一步对每个种30个个体的DNA 进行扩增，其中7种引物扩增出的条带有差异，表明RAPD技术能有效地检测出种群内发生的变异。Blanchetot(1992)利用M13噬菌体DNA 探针和珠蛋白基因重复序列探针，研究苜蓿切叶蜂(Megachile rotundata)的生殖策略，证明了每巢中的后代基本来自单一雌性，且在大多数情况下雌性只与单一雄性交配。

Lu(1994)将DNA 重复序列标记技术应用于秋黏虫(Spodoptera fragiperda)的研究。该物种两个种群的分布区有部分重叠，其中一个种群嗜食玉米，另一个种群则以水稻和饲料用草为食。结果表明：DNA 重复序列标记技术能将两个在形态上无法区分的种群完全地划分开。同时，对秋黏虫种群迁飞、种群结构和生殖行为等也作了研究。赵中明等(2001)应用RAPD技术分析了金色果蝇复合种的5个姊妹种共12个地理种群的遗传变异。在40种10碱基随机引物中有30种引物对每个种群都可获得令人满意的扩增结果，在161个RAPD标记中有129个呈多态性，用UPGMA法构建了该复合种的聚类关系图。

三、RAPD技术在害虫抗药性中的应用

近20年来.为了控制害虫为害，在农作物上大量施用农药.许多害虫已产生了很强的抗药性。抗药性的产生是在杀虫剂施用量不断加大的外界环凌条件下，由于突变和选择的作用，与抗药性有关的遗传变异在种群中产生和扩散的结果。由于害虫遗传学理论尚不完善和缺乏抗性突变体的诊断技术等原因，以往对抗性机理的研究多局限于生理学方面，而极少深人到分子水平。RAPD技术一出现，随即迅速地被用于害虫抗性机理的研究，检测抗性遗传变异，即使在人们对有关抗性基因缺乏深入了解的情况下，也可依赖三抗性基因连锁的DNA 多态性标记对种群的抗性遗传变异进行鉴定。

如芮昌辉等(1996)利用RAPD技术分析了棉铃虫对三氟氯氰菊酯抗性的遗传方式，通过筛选出的3个随机引物在R和S两亲本之间共扩增出47条DNA 带，其中差异带达27条；初步筛选出与抗三氟氯氰菊酯有关的RAPD分子标记3个，即OKG4－1300、OPG6―1450、OPG8―535，它们能同时出现于R亲本和正反交F1代中，而在S亲本中不出现，与抗药性遗传方式的测定结果一致，证明了这种方法的可靠性。Raymond(1991)用此技术研究了库蚊(Culexpipiens)对有效磷农药抗性产生和扩散的机制，证明导致库蚊抗性产生的酯酶B2基因的扩散具有单一起源，并通过迁飞扩散到不同地区。

四、RAPD技术在作物抗虫方面的应用

RAPD和RAPD标记是两个不同的概念。由RAPD扩增获得的DNA 片段经过鉴定后证明可以用作分子标记的，则称之为RAPD标记。Myburg等(1998)开展了小麦对俄罗斯麦蚜抗性基因Dn2连锁分子标记研究，共检测了2 700个位点，其中有4个RAPD片段被鉴定出可推定作为与Dn2基因连锁的标记。F2抗性基因分离表明，这4个片段与Dn2基因紧密连 锁，并用这4个片段作探针进行Southern分析证明了它们的同源性。Blanchetot(1993)利用RAPD和RFLP技术研究了非洲稚虫和中间寄主非洲舌蝇之间的遗传依赖关系.

以及非洲 舌蝇自交系和基因连锁图谱，为非洲舌蝇生物防治靶标的设计提供了依据：Roche等通过抗苹果红二圆尾蚜(Dysaphis devecta)苹果的分子标记研究，找出了与抗性基因（sdl）连锁的3个RFLP标记和4个RAPD标记。并且对它们进行了定位，这些标记的获得和定位在抗性育种中具有良好的应用前景：Heckel等用117条随机引物对小菜蛾抗Bt品系和敏感品系DNA 进行了RAPD标记研究，在所获得的223条扩增带中，105条为敏感品系所特有，118条为抗性品系所特有。

此外，刘春宇等通过对家蚕和蓖麻蚕杂交后代的RAPD检测结果表明，这种科间杂交虽然未发生雌雄核的融合，但却引起了母体基因组结构的变化，在杂交后代的扩增产物中不仅存在着大量与母体相同的扩增带，还出现了―定数量的不同于母体的“变异带”。这种变异带的出现，可能是由于蓖麻蚕精子携带入家蚕卵内的外源DNA ，导致母体原有基因结构发生重排(包括缺失、替换、插入等)所致。这―研究在昆虫外源基因的检测和追踪方面进行了有益的探索。

五、分析昆虫，构建基因图谱

随着分子生物学技术的不断发展，特别是价格低廉、操作简单的RAPD技术的发现，从分子水平上构建昆虫基因图谱已成为可能。Hunt等(1995)利用RAPD标记构建了蜜蜂的基因图谱，该图谱包括26个连锁群，全长161720kb(估计蜜蜂全长为24 150kb)，平均每个10bp引物筛选出的多态性位点达2.8个，并在此基础上，把决定性别的X位点、控制黑色体色的基因和苹果酸脱氢酶基因分别定位于不同的连锁群上。何宁佳等(2001)结合SADF与RAPD标记构建了家蚕连锁图，用40个选择性扩增多态性引物和137个随机性扩增多态性引物对家蚕Bombyxmori F2群体进行分子标记的筛选。

RAPD技术在昆虫学研究中的应用才刚刚开始，随着昆虫分子生物学研究的深入及 RAPD及其相关技术的发展，RAPD技术将与其他技术相结合，在寻找、改造和利用昆虫基因，设计害虫治理新对策及保护、改良益虫的新途径等方面将发挥重要的作用。

(作者：陈青 单位：中国热带农业科学院植保所)